利用微生物技術修復污染土壤的方法

夏明 萬何平 曹新華 孫齊英 周世力

摘要?土壤是人類賴以生存的重要資源，隨著工農業生產的快速發展，土壤污染已成為全球性的重要環境問題。微生物修復技術具有其他土壤修復技術手段無法比擬的優勢，已成為土壤修復領域研究的前沿之一。介紹了原位微生物修復技術和異位微生物修復技術的主要應用類型，對近年來國內外在固定微生物技術、微生物和植物聯合修復技術、高效基因工程菌開發等方面的研究進展進行了綜述，并對今后微生物修復技術的發展趨勢和應用前景進行了展望。

關鍵詞?微生物;土壤修復;固定微生物技術;微生物和植物聯合修復技術

中圖分類號?X53?文獻標識碼?A?文章編號?0517-6611（2020）14-0013-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.14.004

Abstract?Soil is an important resource for human survival. Due to the rapid development of industrial and agricultural activities， soil pollution has become one of the biggest global environmental challenges. Microbiological repair technology， having an advantage over other technical means， has become one of the frontiers in soil restoration research. Here we gave an overview of?in situ?and?ex situ?bioremediation， and their main application types. In addition， we reviewed the recent progress of research on the immobilized microorganism technology， the microbe-plant combined remediation technology， and the development of efficient gene engineering bacteria. The future development trends and application prospects of the microbial remediation technology were prospected.

Key words?Microorganism;Soil remediation;Immobilized microorganism technology;Microbe-plant combined remediation technology

隨著人口的迅速增長和經濟的快速發展，為了維持和改善生活質量，人類需要更多的染料、殺蟲劑以及各種藥物等，盡管這些化學物質中很多都可以被利用或者被降解，但仍然有很多被釋放到空氣、水體和土壤中，我國的土壤污染問題也愈加凸顯出來。工業化快速發展及隨之產生的工業“三廢”的大量排放，城市污染的加劇和農業生產中使用化肥、農藥的增加，導致土壤生態環境質量日益惡化，對人類的糧食安全、生存環境及健康構成了嚴重威脅[1]。

土壤污染主要是由工廠活動產生的廢物、農業使用的化學物質以及生活廢物處置不當引起的。常見的化學物質包含石油烴、多環芳烴、農藥、鉛和其他重金屬元素[2]。直接與已被污染的土壤接觸和由于污染土壤中或土壤下的供應水引起的二次污染都可能對人類健康造成威脅[3]。據統計，全國2014年土壤污染總超標率為16.1%，土壤一旦受到污染，將會進一步污染地下水體等自然生態系統的穩定[4]，甚至影響到糧食和農副產品的質量，且其治理和恢復難度相當大（環境保護部）[5]。全面調查已被污染的土壤區域以及隨后對其實施凈化措施涉及的領域非常多，有地質學、水文學、化學、電腦建模等，還需要充分了解工業化學的發展史，是一項極費時和費錢的工程[6]。

對于污染土壤的修復，傳統的治理方法有物理修復法和化學修復法，但是通過這2種方法來降低土壤中污染物濃度投資大，且不易操作，不適合大范圍推廣應用。化學修復法主要通過使用化學修復劑，使之與土壤中的污染物質發生氧化反應、還原反應、吸附反應、沉淀反應和絡合反應等，達到將土壤中的污染物質分離、降解或轉化成無毒或低毒的形式去除，但去除污染物的同時可能會將化學成分引入到土壤中，從而造成二次污染的環境風險。微生物修復技術是指利用天然存在的土著微生物群、外源微生物群以及采用遺傳工程手段研究和構建的高效降解菌株或人工開發的基因工程菌，適宜的環境條件會加強微生物的代謝作用，從而達到降低土壤中有毒有害污染物活性，或直接使其降解成為無毒物質的目的。微生物個體小，比表面積大;吸收多，轉化快;生長旺，繁殖快;適應強，易變異;分布廣，種類多，同時，微生物營養類型多樣，大體可以分為四大類型：光能無機營養型、光能有機營養型、化能無機營養型和化能有機營養型，可以利用多種物質作為能量來源。微生物修復技術具有其他技術手段無法比擬的優勢，已成為該領域研究的前沿之一[3]。

1?土壤微生物簡介

土壤是微生物的大本營，是微生物生長和繁殖的天然培養基。土壤中微生物具有以下特點：類群豐富，一般包含細菌、放線菌、真菌、藻類和原生動物五大類;數量繁多，一般來說，在每克耕作層土壤中，細菌數量約為108個，放線菌（孢子）數量約為107個，真菌（孢子）數量約為106個，酵母菌數量約為105個，藻類數量約為104個，原生動物約為103個;分布廣泛，由于土壤質地、發育歷史、發育母質、季節、肥力、作物種植狀況、土壤層次和深度等不同，其所含的微生物種類和數量會表現出很大差異，一般在微生物修復過程中起作用最大的是細菌，其次是放線菌和真菌類。土壤微生物可以通過固氮、降解無機磷鉀等改善土壤的物理、化學結構并提高肥力，又可促進植物光合效應、抑制植物病原菌增殖、促進作物生長，還可降解多種重金屬離子實現對污染土壤的修復[5]。

2?污染土壤的微生物修復技術

20世紀70年代以來，隨著微生物處理技術在石油及重金屬污染治理等方面的廣泛應用[7]，在利用微生物來降解有機污染物和重金屬污染土壤的修復等方面取得了較好的效果，該法逐漸取代傳統的化學修復法和物理修復法而成為修復污染土壤的核心技術。從不同的角度，可以對土壤污染修復技術進行不同分類，其中按修復土壤的位置可以將微生物修復技術分為原位修復技術和異位修復技術。

2.1?原位微生物修復技術

原位的意思是指微生物修復發生的地理位置就在受污染的位置，所以原位微生物修復是指不移動受污染的土壤或污染物，而是通過直接在其中添加微生物試劑、營養元素等，以提高土著微生物或外源微生物對土壤有機污染物的降解作用，直接在發生污染的場地對其進行原地修復作用。原位微生物修復技術現已廣泛應用于含有碳氫化合物、氯化物、硝酸鹽、有毒金屬和其他化學反應產生的污染物質的生物修復過程中。原位修復技術主要有生物培養法、投菌法和生物通風處理法等方法。

2.1.1?生物培養法（bioculture）。

生物培養法利用的是受污染土壤中的土著微生物，這一類微生物有的可以降解土壤中的有機污染物，故而可以定期向土壤中投加適合且促進土著微生物生長繁殖所需的營養物作為能源，同時添加氧和過氧化氫作為其正常代謝過程中所需的氫受體（電子受體），在這種適宜條件下，土著微生物可以正常甚至加速新陳代謝和生長繁殖，整個過程中可以將土壤中的污染物轉化為代謝產物或直接降解成二氧化碳和水[8]。此法修復污染土壤的缺點是一般需要時間較長。

2.1.2?投菌法（bioaugmentation）。

如果土壤中的土著微生物無法降解該環境中的污染物質，那么可以采取向該環境中引入外源物種以達到加速降解土壤中污染物質的目的。此法中一般需要加入多種微生物：地衣桿菌（?B.licheniformis）、蘇云金芽孢桿菌（B.thuringiensis）、多粘菌（P.polymyxa）、嗜熱脂肪芽孢桿菌（B.stearothermophilus）、青霉菌（Penicillium?sp.）、曲霉（?Aspergillus?sp.）、黃桿菌（?Flavobacterium）、節桿菌（Arthrobacter）、假單胞菌（Pseudomonas）、鏈霉菌（Streptomyces）和酵母菌（Saccharomyces）?等，同時還需要提供這些微生物生長所需要的營養物，包括N、P、K、S、Ca、Mg、Fe、Mn等，其中N和P是微生物主要的營養元素[9]。有研究表明，在向污染了石油烴的土壤中定期投入混有馬紅球菌、假單胞菌和鞘氨醇單胞菌的混合菌群6個月后，石油烴的去除率達54%。

2.1.3?生物通風處理法（bioventing）。

生物通風法主要用于地下水系統中有機污染物的生物降解，也常用于由地下油管泄漏造成的輕度污染土壤的生物修復，該法在提高土著微生物活性的同時還可以通過在通氣層中通入空氣或氧氣以促進原位生物降解能力。在受污染的土壤中，由于微生物生長繁殖與新陳代謝過程使得其中氧氣濃度降低，能夠發揮降解污染物的微生物生命活動被抑制，從而大大降低土壤中污染物的降解效果，此時向該土壤中通入空氣或氧氣，可以恢復土著微生物的活性，從而繼續達到降解污染物的目的[8]。

2.2?異位微生物修復技術

利用異位微生物修復技術處理污染土壤時，要求將被污染的土壤挖出，搬動或輸送到它處集中起來進行生物修復處理[10]，具有高效且便于監控的特點，但是由于運輸和后期處理過程中存在擴散的可能，所以該法也存在一定的局限性，一般用來處理污染濃度高且污染土壤量不大的區域。異位微生物修復既可以在土壤受污染之初進行處理，又可以通過過程控制器或生物反應器產生有利于生物降解的條件。主要方法有土耕法、生物堆制法、土壤堆肥法、生物泥漿法和預制床法。

2.2.1?土耕法（land farming）。

土耕法是將被污染的土壤或沉積物挖出轉移至土耕位點并放置于處理墊上，以防止污染物轉移，并進行定期翻動以達到往被污染土壤中補充空氣使上部處理帶保持好氧狀態，該法往往還會利用黏土來阻擋露出的污染物以防止地下水污染。土耕法費用極低，時間短，通常60～80 d即可，因此可以在多種污染土壤的生物修復過程中使用，但是其無法處理揮發性有機物，因而會讓這一部分有機物進入大氣造成空氣污染。

2.2.2?生物堆制法（biopile）。

生物堆制法是土耕法的改進形式，是一種將受污染的土壤從污染地區挖掘出來，運送到指定地點（提前布置了防止滲漏襯底、通風管道等）進行生物降解的異位修復技術[11]。這種方法包括將受污染的土壤進行堆放，依靠通風、加入營養物質和微量元素以及增加濕度等手段，模擬土壤中的好氧微生物降解過程以去除土壤中吸附的污染物組分[11]。生物堆制處理技術設計和安裝簡單，修復需要的時間短，但是此方法占地面積較大，若土壤中存在一定濃度的重金屬，可能會抑制生物降解。

2.2.3?土壤堆肥法（composting）。

土壤堆肥法是一種在有氧條件下降解土壤有機污染物的微生物修復方法，且經過修復后的有機物質可以重復利用。與土耕法不同的是，土壤堆肥法還需要額外加入土壤調理劑，土壤調理劑主要包括稻草、糞便等，基本需要含有以下4種營養物質：碳作為能源物質;氮用來維持微生物的生長代謝，同時有助于其產生能氧化碳的有機物質;氧也可以氧化碳從而加快降解污染物的速度;水用來保持微生物活性，且有利于維持有氧環境。與土耕法或生物堆制法相比，土壤堆肥法雖然處理費用略高一點，但可以降低污染土壤的修復時間，且其對去除含高濃度不穩定固體的有機復合物的效率最高。

2.2.4?生物泥漿法（bioslurry treatment）。

生物泥漿法實質是一種生物反應器，將受污染的土壤挖出，去除其中的石塊和碎石之后，與水混合后置于一個容器中（典型的泥漿中會包含10%～30%的固體），隨后加入營養物質以增強微生物降解污染物質的能力，整個過程中可以通過控制溫度、混合強度和營養物質達到降解最大化。處理后的污染土壤干燥后經過檢測確保污染物質已被完全降解后即可再運回原地，經過改良后更可實現可移動化。生物泥漿法已被廣泛用于被三硝基甲苯（TNT）污染土壤的生物修復中。

2.2.5?預制床法（prepared bed）。

預制床法是首先在防止滲漏的平臺鋪上石子和沙子，按10～30 cm的厚度平鋪在處理墊上，以防止污染物轉移，并在表面灑上營養物質和水，同時進行定期翻動，以使受污染土壤與空氣和營養物（有機營養物和無機營養物）充分接觸，滿足微生物生長的需要，處理過程中流出的液體可淋回土壤上，這樣可以使得原土壤中的污染物得到徹底有效降解[8]。但該方法存在著操作復雜且成本較高的問題。

3?微生物修復的發展趨勢

3.1?固定化微生物技術

固定化微生物技術是20世紀60年代在固定化酶技術基礎上發展起來的一種生物修復技術，它是利用化學或物理手段將游離的微生物或酶與特定的載體結合，固定于限定的空間區域，以提高微生物細胞或酶的濃度，使其保持較高的生物活性并可反復利用的方法[7，12]。固定化微生物技術主要包括包埋法、吸附法、包絡法、共價結合法以及交聯法，它們都是將微生物固定在一個限定空間內，只是固定的原理各不相同。包埋法是指將微生物包裹在凝膠格子或聚合物半透膜微膠囊中，吸附法是依據細胞表面與載體表面之間的靜電、表面張力和粘附力，使細胞固定在載體上;包絡法是利用載體材料的多孔性讓微生物在其表面生成機械強度較高的生物膜，同時微生物還會在材料的內孔處形成高密度的群落;共價結合法是利用細胞表面與載體表面形成化學共價鍵從而固定微生物的方法;交聯法是利用微生物菌體相互之間連接形成網狀結構從而達到固定的方法。目前，固定化微生物技術已成為環境科學、生命科學及其相關學科的研究重點[13]。

3.2?微生物和植物聯合修復技術

微生物和植物聯合修復是通過形成土壤-植物-微生物的復合體系來共同降解污染物，從而清除環境污染物，提高污染土壤的修復效率[14]。在這個復合體系中，植物根系可以給微生物提供生活場所，而微生物生長可以促進降解土壤中的污染物，從而促使植物更好的生長[14]，提高植物耐受性，最終通過這種互助作用修復污染土壤[15]。目前，對于微生物和植物聯合修復技術主要應用在兩個方面[16-17]：①改善和提高土壤重金屬污染的修復效果;②在農藥污染土壤修復領域廣泛應用。近年來，利用植物-微生物聯合修復取代單一的微生物修復或單一的植物修復，已成為農藥污染土壤修復領域的研究熱點。

3.3?高效基因工程菌的開發

利用微生物降解污染土壤中的污染物已經得到廣泛應用，但由于污染物種類繁多，尤其是難降解的污染物的存在很大程度上增大了修復難度，延長了修復周期，阻礙了生物修復技術的進一步應用。通過基因工程的手段構建高效環境工程菌可以明顯提高微生物對土壤污染物的降解效率[18]。Plotnikova等[19]成功將一株多環芳烴降解菌（假單胞菌SN11）中的多環芳烴降解質粒轉移到嗜鹽性惡臭假單胞菌BS394中，構建出的基因工程菌可以在高鹽濃度的污染土壤中存活且仍具有較高的多環芳烴類化合物降解能力。

4?展望

生物修復污染土壤具有高效且低成本的特點，其中微生物修復技術更具有降低健康風險、提高生物多樣性以及在天然環境下修復污染生態系統的優勢，在土壤污染的修復實踐中有廣闊的前景和巨大的潛能[20]。雖然已有很多實例證明利用微生物可以降解大部分土壤中的污染物，但是該技術的大規模應用還需要繼續深入研究，今后可以重點從以下方面進行突破：①由于大量環境因子對生物修復速率和程度的影響還未研究透徹，導致在使用過程中有很多不確定性，同時，目前很多的野外試驗設計并不合理科學，且缺少條件控制、分析不夠合理，未來研究過程中試驗設計和數據質量還有待提高，需要從多角度分析微生物修復技術的機理和工藝流程;②有關微生物及其在環境中的地位不同會對其應用產生影響，所以還需要進一步探索具有降解污染物功能的微生物多樣性，探究各類微生物的生理特性，合理運用于對特定污染物的降解;③現有的微生物菌種以及通過各種基因工程改良的菌種已成功運用于多類污染土壤的生物修復過程中，但是還有多種污染物質無法得到有效降解，需要探尋可以適應更多環境的，尤其是尋找和開發極端環境微生物，以適應于不同土壤環境的污染物降解，同時需要繼續篩選、馴化新的高效降解微生物菌種，開發高效降解基因工程菌;④生物修復涉及的生物種類繁多，不同種類的生物也有其不同的應用條件，且不同方法之間交叉使用可以達到事半功倍的效果，所以還需要將微生物修復技術與植物修復技術、電動修復技術、化學鈍化技術、微生物吸附技術等相結合，從而提高修復效果，降低應用成本，增加修復的經濟效益。

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