膿毒癥大鼠心肌功能障礙的常規超聲心動圖與組織多普勒成像分析*

單光華， 徐雅倩， 唐翔詡， 李紅梅， 王彥平， 黎凱穎， 邢 云，戴曉萌， 楊多猛， 呂秀秀， 陸大祥， 王華東△

（1暨南大學附屬第一醫院心血管內科，2暨南大學基礎醫學院病理生理學系，國家中醫藥管理局病理生理學重點實驗室，廣東廣州510632）

膿毒癥心功能障礙是指膿毒癥引起的心肌內在收縮與舒張功能抑制［1］。作為膿毒癥患者常見的并發癥，心功能障礙的發生嚴重影響膿毒癥患者的預后，是加速膿毒癥患者死亡的重要因素［2］。早期診斷并防治膿毒癥誘導的心功能障礙對改善膿毒癥患者的生存具有重要意義。然而，對于膿毒癥患者，臨床上缺乏特異性的反映心肌內在收縮與舒張功能抑制的早期診斷指標。1984 年，Parker 等［3］首次用射血分數（ejection fraction，EF）降低診斷膿毒癥心功能障礙，但EF 受前負荷、后負荷和心肌收縮力的影響，是一個負荷依賴的指標［4］，并不能直接反映心肌內在收縮功能［5］。近年來，脈沖波多普勒超聲心動圖和組織多普勒成像廣泛用于膿毒癥心功能障礙的評價。一般認為，組織多普勒成像測定的二尖瓣外側環舒張早期運動速度E'波峰值以及舒張早期二尖瓣血流速度E 波峰值與E'波峰值的比值（E/E'比值，即左心室充盈指數）可以評價左心室舒張功能障礙［6］。因此，目前一些研究用降低的E'波峰值或增加的E/E'比值診斷膿毒癥誘導的左室舒張功能障礙［7-8］。盡管E/E'比值與左心室充盈壓（left ventricular filling pressure）密切相關，但在某些臨床情況下，E/E'比值與左心室充盈壓缺乏相關性［9］，因此這些指標的變化能否反映膿毒癥早期心肌內在舒張功能抑制，需要進一步研究。因此，本研究利用盲腸結扎穿孔（caecal ligation and puncture，CLP）復制大鼠膿毒癥模型，在膿毒癥早期采用離體心臟灌流、超聲檢測技術評價膿毒癥大鼠心肌收縮與舒張功能變化，旨在探索早期檢測膿毒癥心肌功能障礙的診斷指標。

材 料 和 方 法

1 實驗動物

SPF 清潔級雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠，8～10 周齡，體重220～260 g，購于廣東省中醫藥大學實驗動物中心，許可證號為SCXK（粵）2013-0034。動物分籠飼養、自由飲水進食。實驗前置于暨南大學實驗動物中心適應環境飼養10 d，大鼠于復制CLP模型前12 h 禁食，不禁水。實驗操作嚴格按照暨南大學實驗動物倫理委員會的相關規定進行。

2 實驗器材與主要藥品

心功能檢測儀器包括Langendorff 離體心臟灌流裝置（ADInstruments）；BL-420F生物信號采集處理系統（中國成都泰盟科技有限公司）；Vevo 770?高分辨小動物超聲儀（Visual Sonics Inc.）。主要試劑包括異氟烷（Sigma）；ECL發光液（Millipore）；BCA 法蛋白定量試劑盒（Thermo Scientific）；抗細胞間黏附分子1（intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1）和血管細胞黏附分子1（vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1）抗體（Abcam）；山羊抗兔抗體（北京鼎國公司）；大鼠腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）ELISA 試劑盒（R&D）；分析純氯化鈉、葡萄糖、磷酸二氫鉀、碳酸氫鈉、氯化鉀、硫酸鎂和氯化鈣購自廣州化學試劑廠。

3 實驗分組

將22 只雄性SD 大鼠隨機分為假手術（sham）組和CLP組，每組11只。

4 主要方法

4.1 復制CLP 模型 SD 大鼠經異氟烷吸入麻醉后，將其固定在手術臺上，備皮、消毒、鋪無菌孔巾，于前腹部正中做1.5 cm 長的手術切口，切開皮膚及皮下組織，沿腹白線小心剪開腹壁，避免損傷腹腔臟器，換用無齒鑷，小心地將盲腸提出放置于無菌孔巾上，用沾有無菌生理鹽水的紗布覆蓋在腸管上。利用1 號線在距離盲腸盲端1.5 cm 處結扎盲腸，在盲腸結扎遠端的正中部位，避開血管，用18 號注射器針頭穿孔，來回貫穿5 次，擠出少許腸內容物，將盲腸放回腹腔。分層縫合腹部切口。術后皮下注射生理鹽水（30 mL/kg）進行液體復蘇，術后鎮痛，大鼠放回大鼠籠內，自由飲水進食，室內溫度保持在26℃。假手術組大鼠不予盲腸結扎穿孔，其他操作均同CLP組。

4.2 超聲測定大鼠的心功能 假手術或CLP 術后6 h 將大鼠胸部脫毛，2%的異氟烷吸入麻醉，固定大鼠四肢于操作臺上，于相應超聲探頭接觸部位涂抹超聲耦合劑，選定小動物超聲儀心血管模式，頻率設置為17.5 MHz，運用儀器配套的RMV707B型高頻超聲探頭，對各組大鼠進行實時胸骨旁左心室短軸M型超聲、常規多普勒血流速度及組織多普勒超聲檢測。利用超聲系統軟件對所采集圖像進行測量和數據分析。觀察指標包括左室舒張末期容積（left ventricular end-diastolic volume，LVEDV）、左室EF、左室短軸縮短分數（fractional shortening，FS）、每搏輸出量（stroke volume，SV）、舒張早期二尖瓣血流速度E峰值、舒張晚期二尖瓣血流速度A 峰值、E/A 比值、E'峰值、二尖瓣外側環舒張晚期運動速率A'峰值以及E/E'比值。所有數據的測量和計算均按美國超聲心動圖協會推薦的方法進行，每組數據均為3 個連續心動周期的平均值。

4.3 Langendorff 離體心臟灌流 按下列配方配制K-H 灌流液（g/L）:NaCl 6.896，KCl 0.35，MgSO40.296，KH2PO20.16，NaHCO32.1，glucose 2.18，CaCL20.277 g/L，pH 值調整為7.35。準備消毒后的灌流系統，連接95% O2及5% CO2的混合氣及球囊，檢查整個灌流系統有無氣泡。取超聲檢測后的麻醉大鼠，分離心臟、迅速放入預冷的K-H 液內，致其停博。擠出心臟內的血液，將主動脈插管插入主動脈內，用4 號線結扎。將結扎好的心臟迅速連接到離體心臟灌流系統。剪開左心耳下緣，將球囊插入到左心室內，調節球囊大小，使左心室舒張末壓維持在4～10 mmHg；通過生物信號放大系統，檢測左心室壓力的變化。待心臟灌流跳動趨于穩定后開始記錄，灌流40 min 后計算左室內壓最大上升速率（maximal rate of rise of left ventricular pressure，+dp/dtmax）及最大下降速率（maximal rate of fall of left ventricular pressure，-dp/dtmax）。

4.4 Western blot 實驗 離體心臟灌流后取大鼠心臟，去除心房及右心室，然后取50 mg 左心室組織加1 mL RIPA 裂解液，冰上勻漿后提取總蛋白進行Western blot 分析。首先進行BCA 蛋白定量調整樣本蛋白濃度，后取50 μg左右的蛋白進行SDS-PAGE，半干轉轉膜18 V 恒壓轉膜7 min）。轉膜后，用TBST洗膜3 次。用5%的脫脂奶粉室溫封閉1 h，用抗ICAM-1 和 VCAM-1 抗體（1∶10 000）4℃孵育過夜。用TBST 清洗 3 次，使用山羊抗兔Ⅱ抗（1∶10 000）室溫孵育1 h，再次用TBST清洗3次。使用ECL發光液顯色后壓片，用Quantity One軟件分析條帶。

4.5 ELISA 實驗 超聲檢測各組大鼠后，收集大鼠血清，根據大鼠TNF-α ELISA 試劑盒說明書，測定大鼠血清TNF-α的水平。

5 統計學處理

應用SPSS 13.0 軟件進行統計學分析。正態分布的計量資料采用均數±標準誤（mean±SEM）表示，兩組之間的比較采用獨立樣本t檢驗。利用Pearson或Spearman 相關分析判定參數和非參數變量的相關性。以P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 膿毒癥大鼠血清 TNF-α 含量、心肌 ICAM-1 和VCAM-1表達以及左心室收縮和舒張功能變化

CLP 術后 6 h，CLP 組大鼠血清 TNF-α 水平明顯高于假手術組（P＜0.05），見圖1A。Western blot 結果顯示，CLP 術后6 h，CLP 組大鼠心肌組織中ICAM-1及VCAM-1 蛋白的表達顯著高于假手術組（P＜0.05），見圖1B、C。離體心臟灌流測定左心室內在收縮和舒張功能顯示，CLP 術后6 h，CLP 組大鼠左心室+dp/dtmax及-dp/dtmax均顯著低于假手術組（P＜0.05），見圖1D、E。

2 CLP術后6 h大鼠心臟M型超聲檢測結果

根據大鼠左心室M 型超聲采集圖像測定計算結果顯示，CLP術后6 h，CLP組大鼠LVEDV 和SV均明顯低于假手術組（P＜0.05），但左心室EF 和FS 與假手術組比較差異沒有統計學顯著性（P＞0.05），見圖2。

3 CLP 術后6 h 大鼠心臟脈沖波多普勒超聲檢測結果

根據小鼠左心室多普勒采集圖像測定血流速率得出舒張早期二尖瓣血流速度E 峰值、舒張晚期二尖瓣血流速度A 峰值及E/A 比值。結果顯示，CLP術后6 h，CLP 組大鼠左心室舒張早期二尖瓣血流速度E、舒張晚期二尖瓣血流速度A峰值均明顯低于假手術組，E/A 比值顯著高于假手術組（P＜0.05），見圖3。

4 CLP術后6 h大鼠心臟組織多普勒超聲檢測結果

采用組織多普勒成像檢測，獲得外側二尖瓣環舒張早期運動速度E'峰值以及外側二尖瓣環舒張晚期運動速度A'峰值，并計算E/E'比值。結果顯示，CLP 術后6 h，CLP 組大鼠二尖瓣環舒張早期運動速率E'峰值及二尖瓣環舒張晚期運動速率A'峰值均明顯低于假手術組（P＜0.05），但E/E'比值與假手術組比較差異無統計學顯著性，見圖4。

5 大鼠心臟組織多普勒超聲、脈沖波多普勒超聲檢測指標與心臟灌流指標的相關性分析

線性相關分析結果顯示，E'峰值與-dp/dtmax呈正相關（r=0.460，P=0.005），A'峰值與-dp/dtmax呈正相關（r=0.520，P=0.022），E'/A'比值與-dp/dtmax沒有相關性（r=-0.045，P=0.855），E峰值與-dp/dtmax沒有相關性（r=-0.065，P=0.797），A 峰值與-dp/dtmax沒有相關性（r=0.113，P=0.654）。

Figure 1.The changes of serum TNF-α level，myocardial ICAM-1 and VCAM-1 expression，and left ventricular myocardial contraction and diastolic functions at 6 h after CLP.A:serum TNF-α content；B，C:Western blot analysis of left ventricular ICAM-1 and VCAM-1 expression；D:maximal rate of rise of left ventricular pressure（+dp/dtmax）；E:maximal rate of fall of left ventricular pressure（-dp/dtmax）.Mean±SEM. n=11.*P＜0.05 vs sham group.圖1 CLP術后6 h大鼠血清TNF-α水平、心肌ICAM-1和VCAM-1表達以及左心室心肌收縮與舒張功能的變化

Figure 2.Left ventricular M-mode ultrasound results of the rats in each group at 6 h after CLP.Mean±SEM. n=11.*P＜0.05 vs sham group.圖2 CLP術后6 h各組大鼠左心室M型超聲檢測結果

Figure 3.The detection results of left ventricular mitral valve blood flow rate in each group at 6 h after CLP.Mean±SEM. n=11.*P＜0.05 vs sham group.圖3 CLP術后6 h各組大鼠左心室二尖瓣血流速率檢測結果

討 論

膿毒癥心肌功能障礙是膿毒癥患者常見的并發癥，目前受到廣泛關注，但缺乏確切的定義和有效的診斷指標［10］。近年來，超聲心動圖已成為評價心肌功能障礙的重要工具，可以在疾病的早期評價心肌的收縮與舒張功能［11］，越來越多的臨床研究將組織多普勒成像用于膿毒癥患者心肌功能的評價［12-14］。然而，目前心臟收縮或舒張功能的超聲心動圖檢測結果互相矛盾，并不能為膿毒癥患者提供可靠的預后信息［10］。因此，確立合理的準確反映膿毒癥患者心肌內在收縮與舒張功能的超聲診斷指標、并在未來的膿毒癥研究中加以廣泛應用，對膿毒癥心肌功能障礙的早期診斷與防治、改善膿毒癥患者的生存具有十分重要的臨床價值。本研究利用CLP 建立大鼠膿毒癥模型，在確定存在心肌內在收縮與舒張功能障礙時，利用常規的脈沖波多普勒和組織多普勒測定左心室超聲參數，為尋找合理的診斷膿毒癥早期心肌功能障礙的指標提供實驗基礎。

Figure 4.Tissue Doppler imaging of left ventricle in each group at 6 h after CLP.Mean±SEM. n=11.*P＜0.05 vs sham group.圖4 CLP術后6 h各組大鼠左心室組織多普勒檢測結果

目前的研究基本公認膿毒癥心肌功能障礙屬于一種炎癥性心肌病，炎癥反應在其發生發展過程中發揮重要作用［10，15］。我們前期研究證實重度膿毒癥大鼠在CLP 術后6 h 即出現心肌收縮與舒張功能障礙［16］。本研究發現，CLP 術后 6 h 血清 TNF-α 及心肌組織ICAM-1 與VCAM-1 蛋白的表達顯著升高。我們采用離體心臟灌流技術測定大鼠離體心臟心肌內在收縮（+dp/dtmax）與舒張功能（-dp/dtmax），結果顯示左心室+dp/dtmax及-dp/dtmax顯著低于假手術組，這些結果證實CLP 術后6 h 大鼠存在心肌內在收縮與舒張功能障礙。在離體心臟灌流之前，我們采集大鼠左心室M 型超聲圖像，分析發現膿毒癥大鼠LVEDV 和SV 顯著低于假手術組大鼠，但左心室EF 和FS 與假手術組比較差異沒有統計學顯著性。因此，本研究中左心室EF 并不能客觀反應膿毒癥大鼠左心室心肌的內在收縮功能。一般情況下，左室EF 可以在一定程度上反應左心室心肌的收縮功能，但EF 受前負荷、后負荷和心肌內在收縮力的影響［4］。膿毒癥時大鼠左心室前負荷和后負荷均會發生明顯改變，顯然，超聲檢測獲得左心室EF 并不能作為診斷心肌內在收縮功能障礙的指標。我們進一步利用常規脈沖波多普勒測定左心室舒張早期二尖瓣血流速度E 峰值、舒張晚期二尖瓣血流速度A 峰值以及E/A 比值。結果顯示CLP 術后6 h，CLP 組大鼠左心室舒張早期二尖瓣血流速率E峰值、舒張晚期二尖瓣血流速率A峰值均明顯低于假手術組，E/A比值顯著高于假手術組，似乎E 峰值和A 峰值降低可以反映左室心肌舒張功能障礙，但常規脈沖波多普勒心臟參數E 峰值、A 峰值、E/A 比值同樣受心臟負荷的影響，前負荷顯著降低可引起 E 波降低，甚至 E/A 比值顯著降低［17］。而且，E 峰值和A 峰值與左室-dp/dtmax之間并沒有相關性。因此，本研究發現CLP 術后6 h，膿毒癥大鼠左心室舒張早期二尖瓣血流速度E 峰值、舒張晚期二尖瓣血流速度A 峰值降低可能是容量負荷減少所致，這些超聲指標并不能早期診斷膿毒癥大鼠左心室心肌舒張功能障礙。有研究證實，對于左室EF 正常的心力衰竭患者，組織多普勒成像測定E'峰值以及左室充盈指數E/E'比值是測定左室舒張功能障礙的可靠指標，E'峰值降低和E/E'比值升高均能反應左心室舒張功能障礙［6］。我們利用組織多普勒成像檢測二尖瓣環舒張早期運動速率E'峰值以及二尖瓣環舒張晚期運動速率A'峰值，并計算E/E'比值發現CLP 術后6 h，CLP 組大鼠 E'峰值與 A'峰值均明顯低于假手術組，與左心室-dp/dtmax的變化一致，而且E'峰值和A'峰值均與左心室-dp/dtmax之間存在相關關系。但E/E'比值與假手術組比較沒有顯著差別。這些結果提示，E'峰值與A'峰值降低可以在CLP 術后6 h 反映大鼠左心室心肌內在舒張功能障礙，而E/E'比值并不能反映左心室舒張功能變化。

綜上所述，本研究發現在膿毒癥早期（CLP 術后6 h），左心室EF不能反映心肌內在收縮功能障礙，常規脈沖波多普勒心臟血流參數也不能反映左心室心肌內在舒張功能障礙，組織多普勒成像獲得的二尖瓣環舒張早期運動速率E'峰值以及二尖瓣環舒張晚期運動速率A'峰值的降低可能是反映左心室心肌舒張功能障礙的指標。這些研究為膿毒癥心肌功能障礙的早期診斷提供了有益的實驗依據。然而，本研究尚存在一些不足之處，如沒有測定CLP 術后不同時間點以及不同嚴重程度的膿毒癥大鼠心臟組織多普勒超聲指標的變化等，值得在后續的研究中進一步驗證。