CAT、CYBA及NIK基因與慢性阻塞性肺疾病及相關肺動脈高壓易感性的關系*

謝欣蕓， 耑 冰， 苑 群， 王 曦， 李 萍， 謝 駿， 楊 朝△

（1西北民族大學第一附屬醫院，寧夏回族自治區人民醫院院本部呼吸內科，寧夏銀川750011；2南京醫科大學附屬蘇州科技城醫院呼吸科，江蘇蘇州215153）

慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary diseases，COPD）是一種患病率和致死率均較高的呼吸道疾病，其中肺動脈高壓（pulmonary hypertension，PH）是COPD 常見的并發癥及主要的致死原因之一。隨著環境的改變，COPD 患病率逐年增加，已逐漸成為全球性問題。世界衛生組織的研究表明，COPD 的死亡率居全球致死性疾病的第5位［1］，PH 致死率也隨之升高。

氧化應激機制在驅動COPD 及相關PH 中起著關鍵作用。p22phox又稱細胞色素b-245 α 多肽（cytochrome B-245 alpha polypeptide，CYBA），是由CYBA基因編碼的普遍存在的蛋白質，是產生超氧化物的NADPH 氧化酶（NADPH oxidases，NOXs）的關鍵成分［2］。p22phox表達增加可激活 NOXs 的生成，導致活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）生成增多，繼而激活核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）等信號通路，引起氧化應激損傷。NF-κB 誘導激酶（NF-κB-inducing kinase，NIK）的積累是NF-κB信號通路中的關鍵事件，可導致NF-κB 增加。王萍等［3］觀察到 NF-κB 蛋白與肺血管重塑程度呈正相關，因此可導致肺血管相關疾病。過多的ROS 可由過氧化氫酶（catalase，CAT）分解，以減少氧化應激損傷。目前已有研究表明，CYBA基因 rs1049255 和 rs9932581 位點、CAT基 因 rs1001179 和 rs7943316 位 點 及NIK基 因rs7222094 位點的點突變可導致氧化/抗氧化能力改變，從而介導心血管、呼吸等系統疾病的發生。因此，本研究通過病例-對照研究，探討CYBA、CAT及NIK基因單核苷酸多態性（single nucleotide polymorphism，SNP）與COPD 及相關PH 發病易感性的關系，為進一步闡明遺傳易感基因在COPD 及相關PH 發生發展中的作用機制提供依據。

材 料 和 方 法

1 研究對象納入標準

連續選取2016年11月～2018年5月就診于寧夏回族自治區人民醫院院本部漢族穩定期COPD 患者250 例作為病例組，選取同期我院127 例漢族健康體檢者為對照組。所納入COPD 患者符合2013 年《慢性阻塞性肺疾病診治指南》診斷標準［第1 秒用力呼氣 容 積（forced expiratory volume in one second，FEV1）/用力肺活量（forced vital capacity，FVC）＜70%］［4］。根據超聲心動圖測得的肺動脈收縮壓（pulmonary artery systolic pressure，PASP）將COPD組分為 COPD 相關 PH 組（PASP≥50 mmHg）和 COPD 非PH 組（PASP＜50 mmHg）。PH 診斷根據2015 年國際超聲心動圖PH 的診斷標準（三尖瓣返流速度＞3.4 m/s，PASP≥50 mmHg）［5］。排除標準:胸腔積液、肺間質疾病等引起的限制性通氣障礙及支氣管哮喘；惡性腫瘤；貧血等血液疾病；糖尿病等內分泌疾病；冠狀動脈粥樣硬化性心臟病、先天性心臟病等心血管系統疾病；自身免疫性疾病；嚴重的肝、腎功能損傷；靜脈藥物濫用、使用抑制食欲藥物（如右芬氟拉明、阿米雷司及其衍生物等）引起的PH。所有受試者均遵循自愿原則，已簽署知情同意書，并經過我院倫理委員會批準。

2 研究方法

2.1 DNA 提取 抽取受試者禁食后晨起靜脈血4 mL，置于EDTA 抗凝管內抗凝，嚴格按照AxyPrep 血基因組DNA 小量試劑盒（Axygen）說明書操作，測定DNA濃度后置于-80℃保存備用。

2.2 引物制備 引物設計使用Genotyping Tools 及MassARRAY Assay Design 軟件，并交由北京博奧晶典生物技術有限公司合成。rs1001179 位點的上游引物序列為5'-ACGTTGGATGCAGCAATTGGAGAGCCTCG-3'，下游引物序列為5'-ACGTTGGATGCTGAAGGATGCTGATAACCG-3'，延伸引物序列為5'-GCCCTGGGTTCGGCTAT-3'；rs7943316 位點的上游引物序列為5'-ACGTTGGATGATTGGCTGAGCCTGAAGTCG-3'，下游引物序列為5'-ACGTTGGATGTCCACCCTCAGCAGGCAAAT-3'，延伸引物序列為5'-gaaagCTGCCTGTTGCCCCGAG-3'；rs1049255 位點的上游引物序列為5'-ACGTTGGATGTCGTGTGACCTCGCCCCGGA-3'，下游引物序列為5'-ACGTTGGATGCCCCAGGCAGAGGCTCACG-3'，延伸引物序列為5'-GCAGGTGGGTGCACCTGG-3'；rs9932581 位點的上游引物序列為5'-ACGTTGGATGGTCACTCAGAGCAGGAACC-3'，下游引物序列為5'-ACGTTGGATGCGGTGGCCATGGGGAATAAA-3'，延伸引物序列為5'-TGGCCATGGGGAATAAACCAGCATT-3'；rs7222094位點的上游引物序列為5'-ACGTTGGATGTGCTCGTCTGTTACCTCTCT-3'，下游引物序列為5'-ACGTTGGATGAAGTGCACAGATGGTGGATG-3'，延伸引物序列為5'-CTGCTCCAGTCACGATGGGCACAG-3'。

2.3 測序驗證 使用5 管經二代測序（南京金斯瑞生物科技有限公司）驗證的CYBA基因rs1049255 和rs9932581 位點、CAT基因 rs1001179 和 rs7943316 位點 及NIK基因 rs7222094 位點 SNP 的人類 DNA 作為陽性對照，5 管鮭魚精DNA 作為陰性對照，混雜在待測DNA 樣本中進行SNP 分型，最后結果完全匹配率接近100%。

3 統計學處理

統計分析采用SPSS 19.0 軟件。以Hardy-Weinberg 平衡定律評估樣本的群體代表性。直接計數法統計各位點的基因型頻率與等位基因頻率（%）。基因型頻率、等位基因頻率的對比采用χ2檢驗。用logistic回歸方法計算優勢比（odds ratio，OR）及其95%置信區間（confidence interval，CI），評估各位點基因多態性是否會影響COPD及相關PH的發病率。

結 果

1 臨床資料

本研究共納入 COPD 患者 250 例，其中 COPD 非PH 組 147 例，COPD 相關 PH 組 103 例，健康對照組127 例。年齡、性別和吸煙指數在COPD 組與健康對照組、COPD 非 PH 組與 COPD 相關 PH 組間差異無統計學顯著性，見表1。

表1 健康對照者及COPD組、COPD非PH組和COPD相關PH組患者的臨床資料Table 1.Clinical characteristics of the healthy controls（control group），and the patients in COPD，COPD without PH and COPD with PH groups

2 Hardy-Weinberg平衡檢驗

CYBA基 因 rs1049255 和 rs9932581、CAT基 因rs1001179和rs7943316及NIK基因rs7222094位點的基因型在各組間分布均符合Hardy-Weinberg 平衡，具有群體代表性，見表2～4。

表2 CYBA基因rs1049255和rs9932581位點的基因型在各組間的Hardy-Weinberg平衡檢驗Table 2.Hardy-Weinberg equilibrium of CYBA gene rs1049255 and rs9932581 loci in the studied groups

表3 CAT基因rs1001179和rs7943316位點基因型在各組間的Hardy-Weinberg平衡檢驗Table 3.Hardy-Weinberg equilibrium of CATgene rs1001179 and rs7943316 loci in the studied groups

表4 NIK 基因rs7222094 位點基因型在各組間的Hardy-Weinberg平衡檢驗Table 4.Hardy-Weinberg equilibrium of NIK gene rs7222094 locus in the studied groups

3 在健康對照組與COPD 組之間對比CAT、CYBA和NIK基因所納入SNP位點基因型及等位基因頻率的分布情況

在健康對照組與COPD 組之間，rs1001179 位點基因型及等位基因頻率分布的差異有統計學意義（P＜0.05），而 rs1049255、rs9932581、rs7943316 和rs7222094 位點基因型及等位基因頻率分布的差異無統計學顯著性（P＞0.05），見表5。

4 在 COPD 非 PH 組與 COPD 相關 PH 組之間對比CAT、CYBA 和 NIK 基因所納入 SNP 位點基因型及等位基因頻率的分布情況

在 COPD 非 PH 組 與 COPD 相 關 PH 組 之 間 ，rs1049255 位點基因型及等位基因頻率分布的差異有統計學顯著性（P＜0.05），rs7222094 位點等位基因頻率分布的差異有統計學顯著性（P＜0.05），而rs7222094 位點基因型，以及 rs1001179、rs9932581 和rs7943316 位點基因型及等位基因頻率分布的差異無統計學顯著性（P＞0.05），見表6。

討 論

CAT 主要通過降解過氧化氫生成氧氣和水來抵抗氧化損傷，在人體中所有主要身體器官中都有表達。當短時間內ROS 產生過多時，主要由CAT 發揮抗氧化作用，以維持氧化/抗氧化平衡［6］。而CAT基因單個位點的核苷酸變異可影響其表達水平，使其活性降低，抗氧化能力減弱，導致氧化應激增強，可能參與如肺癌、前列腺癌等的發生。但這種多態性的效果似乎并非在所有研究中呈現一致的方向性。rs1001179 位點位于CAT基因啟動子區域，Mc-Culloygh 等［7］證實，該位點 SNP 與女性乳腺癌發生相關，且CC 基因型可顯著增加女性乳腺癌患病風險。Goulas 等［8］在對血脂異常患者的研究中觀察到該位點TT 基因型與較高的糖化血紅蛋白和血漿甘油三酯水平相關，是增加糖化血紅蛋白和血漿甘油三酯的危險因素。Ershova 等［9］認為該位點 C 等位基因是氧化應激發展中的危險因素，可導致發生氧化應激的風險增加。而本研究檢測到CAT基因rs1001179位點基因型及等位基因頻率分布在健康對照組和COPD 組之間的差異有統計學顯著性（P＜0.05），風險評估顯示，與C 等位基因相比，攜帶T等位基因的受試者COPD 發病風險較低，提示T等位基因可能為保護性因素。進一步對COPD 的常見并發癥PH進行易感性分析，并未觀察到該位點在COPD 非PH組和COPD 相關PH 組之間的差異有統計學顯著性（P＞0.05）。

CYBA基因位于第16號染色體的長臂上，長度為8.5 kb，包括6 個外顯子［2］，rs1049255 位點位于該基因的3'端非翻譯區（3'-untranslated region，3'-UTR）。Xu 等［10］在對急性心肌梗死的風險以及冠狀動脈狹窄程度的研究中闡明rs1049255 位點多態性可能對冠狀動脈粥樣硬化風險具有保護作用，其G 等位基因可能是該病的保護性因素。Zhou等［11］在對終末期腎臟病的基因多態性研究中闡明該位點與NOXs 活性降低和p22phox蛋白含量降低有關，其中GG 基因型和G 等位基因可能是抵抗終末期腎臟病風險的保護因素，這可能是由于GG基因型與ROS產生減少和氧化應激減弱有關。本研究觀察到rs1049255 位點基因型及等位基因頻率在中國寧夏地區漢族COPD 相關PH 及COPD 非PH 患者之間的差異有統計學顯著性（P＜0.05）；風險評估顯示，與GG基因型相比，攜帶AA基因型的 COPD 患者 PH 發病率較高，與 G 等位基因相比，攜帶A 等位基因的COPD 患者發生PH 風險較高，GG 基因型及G 等位基因可能為PH 的保護性因素。

表5 健康對照組與COPD組間CAT、CYBA和NIK基因SNP位點基因型及等位基因頻率的對比Table 5.Distribution of genotypes and alleles of CAT，CYBA and NIK gene SNP loci in control and COPD groups

NF-κB 是一種核轉錄因子，通過 NF-κB 介導的信號通路，可以激活核調節的多種炎癥因子的表達［12］。該信號通路的關鍵事件是NIK 的積累，可間接引起炎性因子增加，介導COPD 或COPD 相關PH的發生［13］。本研究檢測到NIK基因 rs7222094 位點等位基因頻率在COPD 非PH 組與COPD 相關PH 組之間的差異有統計學顯著性（P＜0.05），但該位點尚未被廣泛研究。Thair等［14］觀察到該位點的SNP與感染性休克患者死亡率顯著相關，基因型為CC 純合子的患者死亡率將顯著增加。本研究的風險評估顯示，與C 等位基因相比，攜帶T 等位基因的COPD 患者發生PH 的風險將減低，提示C 等位基因可能是風險等位基因，但本研究尚未檢測到該位點基因型在組間的差異有統計學顯著性（P＞0.05）。此外，rs9932581 和rs7943316 位點在各組間的差異無統計學顯著性（P＞0.05），可能與種族、地域差異、檢測方法、樣本量大小等因素均有關。

綜上所述，CAT基因rs1001179 位點T 等位基因可能為COPD 的保護因子，可降低COPD 發病風險；CYBA基因 rs1049255 位點 GG 基因型和 G 等位基因及NIK基因rs7222094 位點T 等位基因可能為COPD相關PH 的保護因子，可降低COPD 相關PH 發病風險。因此對于某些COPD 及其相關PH 高危患者，可進行基因檢測，早期預防及干預，這為COPD 及其相關PH基因易感性的個體化預防提供了新線索。

表6 COPD非PH組與COPD相關PH組間CAT、CYBA和NIK基因SNP位點基因型及等位基因頻率的對比Table 6.Distribution of genotypes and alleles of CAT，CYBA and NIK gene SNP loci in COPD without PH and COPD with PH groups