尼古丁對多種干細胞中煙堿型乙酰膽堿受體表達的影響*

邱 敏， 李曉紅， 黃茲銳， 陳 景， 周成斌， 陳寄梅， 莊 建△

（1華南理工大學醫學院，廣東廣州510641；2廣東省人民醫院，廣東省心血管病研究所，廣東省華南結構性心臟病重點實驗室，廣東廣州510080）

吸煙會增加吸煙者罹患各種腫瘤和心血管疾病等的風險，同時孕期煙草或尼古丁的暴露對母體和胎兒的健康均有不良影響［1-2］。吸煙也是導致過早死亡的主要原因。尼古丁作為香煙中的一種關鍵化合物，除了上癮外，它還可能導致各種不良的健康問題。大量的研究報道尼古丁對干細胞的增殖、分化、遷移等均有不同程度的影響［3-4］，且其機制與多種煙堿型乙酰膽堿受體（nicotinic acetylcholine receptors，nAChRs）有關，尼古丁是這些受體重要的激動劑［5］。而干細胞中本身的以及尼古丁暴露后的nAChRs 的表達差異有待而進一步研究。本研究以4 種干細胞——人胚胎干細胞系H9、人誘導多能干細胞（induced pluripotent stem cells，IPSC）、人臍帶間充質干細胞（umbilical cord mesenchymal stem cells，UCMSC）和人骨髓間充質干細胞（bone marrow-derived mesenchymal stem cells，BMMSC）為研究對象，觀察尼古丁處理前后這些細胞上nAChRs 表達情況及變化，為探究尼古丁的作用機制提供理論基礎。

材 料 和 方 法

1 材料

1.1 細胞 H9 細胞和IPSC（北京賽貝生物技術有限公司）；BMMSC（賽業生物科技有限公司）；UCMSC來自健康足月剖宮產胎兒臍帶（已獲得廣東省人民醫院倫理審批及產婦知情同意）。

1.2 試劑 尼古丁和胰酶（Sigma-Aldrich）；E8 人多潛能干細胞培養基和人多潛能干細胞消化液（含EDTA）均購自北京賽貝生物技術有限公司；DMEM/F12 和澳洲胎牛血清（Gibco）；Matrigel（BD）；青霉素和鏈霉素（華北制藥公司）；RIPA 裂解液和PMSF 蛋白酶抑制劑（Solarbio）；TBST 緩沖液（上海生工生物工程股份有限公司）；逆轉錄試劑盒（PrimeScript RT Master Mix）和SYBR Premix Ex Taq? II試劑盒（TaKa-Ra）；瓊脂糖、TAE 和 DNA 染液（Thermo Fisher）；PVDF膜（Millipore）；SDS-PAGE預制膠（Genscript）。

1.3 儀器 CO2培養箱（Thermo Forma）；T25 培養瓶和6 孔培養板（無錫耐思生物科技有限公司）；載玻片（Invitrogen）；凝膠電泳儀（北京華圣科儀實驗設備有限公司）；Western blot 電泳槽（Bio-Rad）；FACSAria 分光光度計（BD）；酶標儀（南京華東電子集團醫療裝備有限責任公司）；SimpliAmp 梯度PCR儀（Thermo Fisher Scientific）；5810R 離心機和5415R冷凍離心機（Eppendorf）；NanoDrop 2000超微量生物檢測儀（Gene Company Limited）；ViiA 7 熒光定量PCR儀（Applied Biosystems）；SP5-FCS激光掃描共聚焦顯微鏡（Leica）。

2 方法

2.1 細胞培養及尼古丁處理

2.1.1 H9 細胞與IPSC 培養 用復蘇培養基復蘇后，觀察細胞形態并于48 h 后更換E8 培養基，期間用EDTA 進行消化傳代，所有使用的培養板和瓶均用低生長因子基質膠包被至少1 h。

2.1.2 UCMSC 分離及培養 用PBS 洗滌剪碎后的健康足月剖宮產胎兒臍帶，加入0.2% Ⅱ型膠原酶、青霉素和鏈霉素消化6 h；過濾并將濾液離心，沉淀重懸，接種到培養皿中。觀察細胞貼壁之后，更換培養基，可進行傳代培養、凍存等后續操作，取第3～5代進行實驗。

2.1.3 BMMSC 培養 使用DMEM/F12 加10%胎牛血清常規培養，期間用0.25%胰酶-EDTA 進行消化傳代。

4 種細胞均鋪在6 孔板中，培養在37℃、5% CO2溫箱中，尼古丁加入相應培養基中配成濃度為1 μmol/L 的尼古丁處理液，待細胞密度待到生長成60%～70%時，處理組更換為尼古丁處理液，培養48 h后收集細胞。以上實驗重復3次以上。

2.2 總蛋白提取及Western blot 檢測nAChRs 蛋白水平 采用RIPA 裂解緩沖液（并加入PMSF）從細胞中提取總蛋白，用BCA 法進行蛋白定量，取30 μg 蛋白溶解產物進行電泳，然后轉到PVDF 膜上，條件為恒壓110 V、150 min，之后PVDF 膜用5%的牛奶在TBST緩沖液中低速搖床上封閉1 h，在4℃條件下與I抗（抗nAChRs 各種亞基的抗體）孵育過夜，然后用TBST 洗滌3次，在4℃條件下，孵育相對應的II抗，約45 min，取適量A、B 兩種顯影試劑，按照1∶1 的比例混合配置成顯影液，顯影后檢測nAChRs蛋白表達情況。以上實驗重復3 次以上。所用抗體的詳細情況見表1。

2.3 總 RNA 提取及 RT-PCR 檢測 nAChRs 的 mRNA水平 細胞接種于6 孔板用PBS 洗3 次之后，每孔加入1 mL TRIzol，冰上裂解5 min，然后收集到EP 管，每管加入氯仿200 mL，震蕩后室溫靜置10 min，隨后4℃、12 000 r/min 離心15 min，取上清于新的EP 管，加入 500 mL 異丙醇，震蕩15 s，靜置10 min，4℃、12 000 r/min 離心 15 min，棄上清。加入 1 mL 冷 75%乙醇，混合后4℃、7 500 r/min 離心5 min，棄上清，重復2 次，適度晾干，加入適量無酶水溶解，測濃度。根據逆轉錄試劑盒進行轉錄得到cDNA。PCR 條件:93℃預變性；93℃ 40 s、58℃ 30 s、72℃ 60 s 進行 35次循環；72℃保溫7 min。引物序列見表2。產物進行瓊脂糖凝膠電泳。

表1 Western blot及細胞免疫熒光實驗用抗體Table 1.The description of the antibodies used in Western blot（WB）and cellular immunofluorescence（IF）

2.4 細胞免疫熒光檢測nAChR 的表達位置 細胞用PBS 洗3 次，4%多聚甲醛固定過夜10 min，0.1%Triton 滲透。載玻片在封閉液中封閉1 h，用抗nAChRs各種亞基的抗體在4℃孵育過夜。PBS洗后，用驢抗兔免疫球蛋白IgG（H+L）孵育載玻片，用DAPI進行核染色。用激光掃描共聚焦顯微鏡拍照。使用的抗體如表1所示。

2.5 RT-qPCR 檢測尼古丁處理前后nAChRs的表達變化 使用TRIzol 試劑提取的并純化RNA，并使用逆轉錄酶試劑盒進行逆轉錄，得到cDNA。根據制造商（TaKaRa）的說明，使用SYBR Premix Ex Taq? II 主混合試劑盒進行qPCR。引物序列見表2。將被測基因的Ct 值與內參照GADPH 的Ct 值進行歸一化，得到各基因的相對表達水平。

3 統計學處理

采用SPSS 13.0 軟件進行統計學分析。實驗結果以均數±標準差（mean±SD）表示。兩組間均數比較采用t檢驗。以P＜0.05 表示差異具有統計學意義。

結 果

1 細胞形態

細胞在T25 瓶中培養，細胞形態均一，狀態良好。各類型的細胞形態存在明顯差異，成體干細胞（BMMSC 和UCMSC）呈梭形，旋渦狀生長；H9 細胞和IPSC是圓形，克隆樣生長，見圖1。

2 nAChRs亞基的mRNA表達水平

RT-PCR 產物經過瓊脂凝膠電泳顯示，H9 細胞表達α2、α3、α4、α7、α9、β1 和β2；IPSC 表達α3、α4、α7、α9、β1 和β2；BMMSC 表達α2、α3、α7、α9 和β1；UCMSC表達α2、α3、α4、α7、α9、β1和β2，見圖2。

表2 PCR相關引物序列Table 2.The sequences of the primers for PCR

Figure 1.The morphological observation of different stem cells（scale bar=400 μm）.H9:human embryonic stem cells；IPSC:induced pluripotent stem cells；BMMSC:bone marrow mesenchymal stem cell；UCMSC:umbilical cord mesenchymal stem cells.圖1 各種干細胞的形態觀察

3 nAChRs亞基的蛋白表達

Western blot 結果顯示，在蛋白水平，2 種胚胎干細胞的nAChRs 亞基表達較一致，H9 細胞和IPSC 中均表達α2、α3、α4、α7、α9和β1；而在成體干細胞中，UCMSC 表達α2、α3、α4、α7、α9 和β1 這6 種nAChRs亞基，類似于多能干細胞，BMMSC 僅表達α4、α7、α9和β1這4種nAChRs亞基，見圖3。

4 nAChRs亞基的免疫熒光檢測

細胞中受體表達雖有差異，但在4 種細胞中的定位無明顯差異，其中α3亞基主要位于細胞核，α4、α9 和β1 亞基位于細胞質中，α2 和α7 亞基位于細胞核和細胞質中，見圖4。

5 尼古丁對nAChRs表達的影響

比較尼古丁處理48 h 后細胞中nAChR 的mRNA水平，與對照組相比，H9 細胞的α2 和α9 顯著下調（P＜0.01），而α3、α4 和β1 顯著上調（P＜0.01）；IPSC中，α2、α3和β2顯著上調（P＜0.01）；BMMSC 中，β2顯著上調（P＜0.01）；而UCMSC 中，α2 和β2 顯著下調（P＜0.01）。見圖5。

Figure 2.The mRNA expression of nAChR subunits in various stem cells detected by RT-PCR and showed by agarose gel electrophoresis.H9:human embryonic stem cells；IPSC:induced pluripotent stem cells；BMMSC:bone marrow mesenchymal stem cells；UCMSC:umbilical cord mesenchymal stem cells.M:DNA marker；GAP:GAPDH.圖2 RT-PCR 和瓊脂糖凝膠電泳檢測各種干細胞內nAChRs亞基的mRNA表達

Figure 3.The protein expression of nAChR subunits in various stem cells detected by Western blot.H9:stem human embryonic cells；IPSC:induced pluripotent stem cells；BMMSC:bone marrow mesenchymal stem cells；UCMSC:umbilical cord mesenchymal stem cells.圖3 Western blot 檢測各種干細胞內nAChRs 亞基的蛋白表達

討 論

雖然尼古丁的毒理作用被廣泛研究，但其致病機制或者對細胞功能的調控機制仍需進一步探索。而胚胎、胚胎樣及成體干細胞具有強大的增殖能力和多向分化潛能，在適宜的體內或體外環境下具有分化為肌細胞、肝細胞、成骨細胞等多種細胞的能力，亦可成為體外多種疾病研究的細胞模型［6］，因此成為臨床和科研的關注熱點。有研究發現，電子煙成分的氣溶膠能對H9 細胞產生毒性［7］，而尼古丁可誘導非人靈長類動物的胚胎干細胞向成纖維細胞轉變［8］。還有報道指出，尼古丁抑制間充質干細胞（mesenchymal stem cells，MSC）的再生，MSC 在低濃度尼古丁作用下增殖被抑制，而相對高濃度的尼古丁則促進其增殖［9-10］。這些研究表明，尼古丁等環境因素在干細胞的廣泛運用過程中會起一定的影響作用，然而對于干細胞中以尼古丁為激動劑的nAChRs的表達情況目前還鮮有報道。因此，我們研究了干細胞中nAChRs 亞基的表達以及其受尼古丁調控的影響，并試圖揭示其規律。

nAChRs 屬于配體門控通道受體，由各種不同亞基組成的同源及異源性五聚體構成，在哺乳動物中發現存在 16 個亞基（α1～7、α9～10、β1～4、δ、ε 和γ），其中α1、β1、δ、ε 和 γ 屬于肌肉型受體，其余是神經性型受體［11］。本研究發現 H9 細胞、IPSC、UCMSC 和BMMSC 明顯表達nAChRs 部分亞基，但情況各不相同。在 mRNA 和蛋白水平上，H9 細胞、IPSC 和UCMSC 均表達 α2、α3、α4、α7、α9 和 β1。IPSC 是認為誘導的具有胚胎干細胞特性的一類細胞，這可能解釋了H9細胞與IPSC的受體表達情況相似的原因。而蛋白水平上，BMMSC 僅部分受體亞基表達明顯。同時，所有這些受體亞基可能在細胞的增殖、分化、凋亡等過程中發揮作用。然而，在蛋白水平上，4 種細胞均未檢測到β2亞基的表達。β2亞基對nAChRs中乙酰膽堿等結合位點和有效離子通道的形成是不可或缺的［12］，其他亞基與β2 形成結合體已被多項研究報道是尼古丁發揮作用的重要成分。4 種細胞均源自人類，但分化存在差異，與成熟的分化組織距離不同，因此我們的結果提示干細胞的分化潛能越高，表達nAChRs 亞基的種類就越多。細胞免疫熒光檢測到同一受體在不同類型細胞上的定位是一致的，但不同受體亞基之間的定位存在差異，可以表達于細胞核，也可以表達于細胞質中，也有的同時位于細胞核和細胞質中，因此我們推測不同nAChRs可能在不同的時間和空間上發揮不同的功能。

尼古丁作為nAChRs的激動劑，對受體的改變可能是影響細胞功能的原因。1 μmol/L 的濃度接近吸煙者血液中尼古丁生理濃度的均值［13］，因此本研究選擇1 μmol/L 濃度的尼古丁處理細胞。我們也猜測不同干細胞的nAChRs 被尼古丁影響的情況可能與分化潛能有聯系。在尼古丁處理后，本研究亦發現nAChRs 亞基表達發生變化，且在不同細胞中變化不一致，其中分化潛能最高的H9 細胞中多種受體亞基均發生改變，提示H9 細胞對尼古丁的高敏感性，即分化潛能越高，對尼古丁的調控越敏感。另外，尼古丁作用后α2 亞基在H9 細胞中上調，而在IPSC 和UCMSC 中表達下調。α2的研究目前較少，其改變與酒精、吸煙等效應有關，在大量吸煙青少年中表達增加［14］。這些差異可能是不同細胞對尼古丁的敏感性存在差異的原因。α7 作為調節炎癥、細胞增殖分化等多種功能的受體亞基［15］，在本研究中未檢測到尼古丁對其表達的明顯影響。因此，我們發現尼古丁對干細胞中nAChRs 的調控確實存在，但是α7 亞基的穩定性最強，在多種干細胞中均不受生理濃度下的尼古丁調控，這也解釋了α7 在多種細胞中發揮重要作用且被廣泛報道的原因，但具體機制需進一步探究。

Figure 4.The expression of nAChR subunits in different stem cells was detected by immunofluorescence staining（scale bar=50 μm）.DAPI staining was performed to visualize nuclei（blue），while the nAChR subunits exhibited red or green fluorescence.圖4 免疫熒光檢測nAchRs亞基在各種干細胞中的表達

Figure 5.The mRNA expression levels of nAChR subunits in various stem cells treated with 1 μmol/L nicotine were detected by RT-qPCR.Mean±SD. n=6.*P＜0.05，**P＜0.01 vs control group.圖5 1 μmol/L的尼古丁處理前后各種干細胞中nAChRs亞基mRNA表達的變化

本研究對多種干細胞中尼古丁受體及尼古丁暴露后受體的變化進行了探究，發現不同干細胞中nAChRs 亞基存在表達差異，表明這些細胞對尼古丁的敏感性也是有差異的，需要進一步研究不同亞基的具體功能及其在疾病發生的作用。同時，考慮到干細胞的分化潛能高低及其所處的時期，結合本研究發現的尼古丁影響干細胞nAChRs 亞基表達的情況，我們推測尼古丁可能在胚胎生長發育早期的影響更大，但需要進一步研究證實。而尼古丁使干細胞發生表觀遺傳學的改變可能也是重要且值得進一步研究的機制。