安化黑茶減輕高脂誘導的ApoE-/-小鼠非酒精性脂肪肝*

張文將， 劉圓月， 易 健， 張曉芹， 侯菊花， 劉柏炎△

（1陜西中醫藥大學基礎醫學院，陜西咸陽712046；2益陽醫學高等專科學校，湖南益陽413000；3湖南中醫藥大學，湖南長沙410208）

隨著人們飲食結構和生活方式的改變，非酒精性脂肪性肝病（non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）的發病率呈現上升趨勢，成年人NAFLD 患病率為17%～33%，已成為僅次于病毒性肝炎的第2大肝病，尤其在肥胖和超重的人群中最為多見，如若病情持續發展，導致肝細胞反復變性壞死，最終將會轉化為肝硬化甚至肝細胞癌［1-4］。

目前NAFLD 缺乏一線有效的治療藥物，替代藥物具有潛在的肝毒性和腎毒性。臨床實踐指南認為抗氧化劑的應用可以減輕肝臟脂肪變性和炎癥反應［5］。茶作為一種公認的天然抗氧化劑，為NAFLD預防和治療提供了新的思路。安化黑茶作為一種以綠茶為原料的后發酵茶，隸屬黑茶類，在發酵的過程中產生了茶黃素、茶紅素、茶褐素、冠突散囊菌等新的物質，其中冠突散囊菌存在類他汀成分［6］，是具有很大優勢的微生物［7-8］。本課題組前期實驗證實安化黑茶可顯著降低載脂蛋白E 敲除（apolipoprotein E knockout，ApoE-/-）小鼠體重、肝脾重量和肝指數，抑制腹部、腎周部位脂肪的合成，降低血清中甘油三酯（triglyceride，TG）和低密度脂蛋白含量并抑制炎癥因子的表達［9］。由此可見，安化黑茶具有很好的調節脂類代謝紊亂的效果。內源性脂類物質合成增加是造成脂代謝紊亂的重要因素，與NAFLD 的發生密切相關。但安化黑茶能否抑制內源性脂類物質的合成，以往的研究中鮮有報道，需要通過動物實驗來探索其相關機制。于是，本研究采用ApoE-/-小鼠配合高脂飼料喂養的方法復制NAFLD 模型，應用羥甲基戊二酸單酰輔酶A 還原酶（hydroxymethyl glutaryl coenzyme A reductase，HMGCR）、過氧化物酶體增殖物激活受體γ（peroxisome proliferator-activated receptorγ，PPAR-γ）和硬脂酰輔酶A脫飽和酶1（steroyl coenzyme A desaturase-1，SCD-1）3 個指標來觀察安化黑茶對于脂類合成的相關影響，通過檢測超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）和谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）活性及丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量來觀察安化黑茶預防性給藥的抗氧化效果，通過肝臟丙氨酸轉氨酶（alanine aminotransfease，ALT）和天冬氨酸轉氨酶（aspartate transaminase，AST）檢測來判斷肝細胞受損情況，以期深入研究安化黑茶預防NAFLD 的相關機制。

材 料 和 方 法

1 材料

1.1 實驗動物 8 周齡雄性SPF 級ApoE-/-小鼠50只，購于南京大學模式動物研究所，體質量（25±5）g，品系名ApoE Cas9-KO，品系編號T001458，遺傳背景C57BL/6，配 繁信 息 為-82bp/wt 配 B6J，基 因 型為（ApoE）KO/KO，許可證號為SCXK（蘇）2015-0001；8周齡野生型C57BL/6J 雄性小鼠10 只，許可證號為SYXK（湘）2016-0002。本次實驗通過了湖南中醫藥大學倫理委員會審查，動物倫理批準號為20171001，實驗單位許可證號為SYXK（湘）2013-0005。

1.2 藥物及試劑 2014年天茯茶（安化黑茶的一個品種，由湖南省白沙溪茶廠出品）；阿托伐他汀（輝瑞制藥有限公司，規格:10 mg，批號 110590）；MDA 測定試劑盒（TBA 法）、GSH-Px 測定試劑盒（比色法）、總SOD 測定試劑盒（WST-1 法）、ALT 測定試劑盒和AST 測定試劑盒購于南京建成生物工程研究所；TRIzol Reagent（Invitrogen）；TB GreenTMPremix Ex TaqTM（TaKaRa）；RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit（Thermo Scientific）。

1.3 飼料配方 高脂飼料（型號:H10141）由北京華阜康生物科技股份有限公司提供，生產許可證號為SCXK（京）2014-0008，含21%脂肪和0.15%膽固醇，具體配方:膽固醇、碳酸鈣、玉米油、無水奶油、酪蛋白、蛋氨酸、麥芽糖糊精、玉米淀粉、纖維素、礦物質混合物和維生素混合物。

1.4 主要儀器 高速冷凍離心機（Hermle，型號:Z32HK）；分光光度計（島津，型號:UV-1700）；多功能酶標儀（PerkinElmer，型號:Enspire）；光學顯微鏡（奧林巴斯，型號:BX-51）；核酸蛋白濃度測定儀（BioDrop）；PCR 擴增儀（Bio-Rad）；熒光定量PCR 儀（Eppendorf）。

2 方法

2.1 藥物制備 黑茶每天飲用量按照推薦成人飲用量每天10 g，將2014 年白沙溪牌天茯茶用干凈茶刀撬下少許，稱量至所需量，隨后戴無菌手套將所撬茶葉掰成小塊，用無菌紗布包裹系緊，放入無菌燒杯中，加入實驗室Ⅲ級水，加水量高于茶葉2～3 cm并浸泡30 min，隨后將燒杯放在實驗電爐上進行加熱，武火煮開后改為文火慢燉30 min 左右，冷卻后過濾，取汁另置，將黑茶殘渣加蒸餾水適量（與藥渣齊平）繼續煎熬，沸騰后冷卻少許，將兩次藥液合并一起小火濃縮至所需體積，2 683×g離心 15 min 后，取上清液濃縮成含生藥量，將上述藥液用無菌紗布過濾后放入消毒磨口瓶中，4℃冰箱保存備用。為防止藥液變質，每次濃縮的藥量用1 周左右。參考茶吸收試驗中60 kg 成人每日推薦飲用量為10 g，即每人每日為166.7 mg/kg，根據人和動物的體表面積換算小鼠所用劑量為 1.44 g·kg-1·d-1［10］。黑茶高、中、低劑量分別為 2.16、1.44 和 0.72 g·kg-1·d-1，相當于人體推薦劑量的13.5、9 和4.5 倍。阿托伐他汀按照 10 mg·kg-1·d-1劑量進行灌胃，實驗前將藥片放入干凈研缽中碾碎，加入所需體積的生理鹽水溶解，現配現用。

2.2 小鼠飼養 實驗小鼠飼養于SPF 級獨立通氣籠盒中，儀器壓差20 Pa，溫度（24.0±0.5）℃，相對濕度（50%～70%），晝夜光照節律。ApoE-/-小鼠采用高脂輻照飼料，飼料于-20℃低溫保存，短期使用于4℃保存；空白對照組小鼠予以普通生長飼料（湖南斯萊克景達實驗動物公司提供）；飼養密度為每籠5 只小鼠，飲水為Ⅲ級水，自由飲水；墊料按照一周3 次的頻率予以更換，定期對籠具及水瓶進行消毒。

2.3 動物分組、造模與給藥 實驗動物適應性飼養1 周后，隨機將50 只8 周齡ApoE-/-雄性小鼠分為模型組（10 mL/kg 生理鹽水灌胃）、阿托伐他汀組及安化黑茶高、中、低劑量組，每組10 只，每天定量給予高脂飼料喂養；另取10 只8 周齡的雄性C57BL/6J 小鼠作為空白對照組（10 mL/kg 生理鹽水灌胃），每天定量予以普通生長飼料喂養。各組小鼠每天早晨9 點左右給予藥物灌胃干預，連續給藥17周［11-13］。

2.4 標本收集與處理 各組小鼠于灌胃給藥第17周末禁食不禁水12 h，腹腔麻醉后摘除眼球取血，收集于 1.5 mL EP 管中，室溫靜止 2 h 后 12 000×g、4℃離心15 min，移液器收集血清后分裝于EP 管中，保存于-80℃待測。采用頸椎脫臼處死小鼠，遂將小鼠放置于冰上操作取材，腹腔打開暴露肝臟，用眼科剪迅速剪掉整個肝臟，放在袖珍型精密天平上稱量肝臟重量，預冷生理鹽水漂洗后剪取同一部位部分肝臟小葉放入4%多聚甲醛中用于HE 染色；稱取100 mg 左右肝臟組織放入無RNA 酶的凍存管中，加入1 ml 預冷TRIzol，迅速放入液氮中進行速凍，隨后將標本移至-80℃冰箱中備RT-qPCR 檢測；部分肝臟組織放入無RNA 酶的凍存管中液氮速凍后移至-80℃冰箱保存以備肝功能和氧化應激指標的檢測。

2.5 氧化應激指標的測定 從-80℃冰箱中取小鼠肝組織若干，在冰生理鹽水中漂洗，除去血液，濾紙擦干，放入無菌離心管中，用消毒眼科剪盡量將肝組織剪碎，加9 倍冰生理鹽水于自動勻漿機冰上操作制成10%肝勻漿，4℃、670×g離心15 min，取上清液加生理鹽水稀釋成適宜濃度備測，測定肝臟組織中SOD 和GSH-Px 活性及MDA 含量，預實驗得出最佳抑制率后進行正式實驗；將所得數值代入公式中計算并進行數據分析。

2.6 肝功能檢測 取10%肝勻漿用BCA 試劑盒測定各組樣本的蛋白濃度，按照說明書步驟進行操作，計算出肝組織中ALT和AST的活性。

2.7 病理形態學檢測及評估 多聚甲醛固定肝臟組織后轉移4℃冰箱中保存，48 h 后常規脫水包埋處理，4 μm 厚度切片染色，顯微鏡下觀察肝臟形態，拍照對比。按照《NASH 臨床研究網病理工作指南》對NAFLD 活動度積分（NAFLD activity score，NAS）進行半定量分析［14］。

2.8 RT-qPCR檢測

2.8.1 引物設計 從NCBI 網站搜索小鼠以下基因mRNA 序列，采用Primer 6.0 軟件設計引物，引物序列信息見表1。

2.8.2 組織總RNA 的提取 采用TRIzol 法來提取小鼠肝臟組織中的總RNA。用液氮低溫研磨法對肝臟組織進行研磨，用無RNA 酶200 μL 的吸頭收集研缽中的肝臟組織粉末，轉移至1.5 mL 的無RNA 酶的EP管中，加入1 mL TRIzol室溫放置10 min。按照Invitrogen 所提供的說明書步驟提取肝組織中的總RNA。用移液器抽取2 μL 的RNA 提取液采用核酸蛋白濃度測定儀對濃度進行檢測，并記錄吸光度比值（A260/A280），從而判斷 RNA 提取的質量（A260/A280在1.8～2.0之間說明RNA的質量較好）。

2.8.3 RNA 逆轉錄為cDNA 具體步驟按照Ther-mo Scientific 所提供的實驗操作步驟進行。總反應體系20 μL。逆轉錄第1步，RNA 變性:模板RNA（總RNA）4 μg，Oligo（dT）18引物 1 μL，加 RNase-free water 配成 12 μL 體系，于 65℃孵育 5 min 進行變性，完畢后迅速于冰上冷卻。將RNA 逆轉錄為cDNA 第1鏈:5× Reaction Buffer 4 μL、RiboLock RNase Inhibitor（20 U/μL）1 μL、10 mmol/L dNTP Mix 2 μL 和 RevertAid M-MuLV逆轉錄酶（200 U/μL）1 μL瞬時渦旋混勻，置于冰盒中備用，再放入提前預熱的PCR 儀中完成以下程序的設置:42℃60 min→70℃ 5 min→4℃，完成RNA逆轉錄為cDNA第1鏈。

表1 RT-qPCR引物序列Table 1.The sequences of the primers for RT-qPCR

2.8.4 RT-qPCR 擴增 根據上海生工所提供的相應引物的Tm值設置56、58、60和62℃4個退火溫度梯度，根據溶解曲線確定最佳的退火溫度，然后進行正式的RT-qPCR 擴增，具體反應條件為:95℃2 min；95℃ 15 s，60℃ 1 min，循環40次。

2.8.5 結果分析方法 內參照選用β-actin，采用2-ΔΔCt法進行相對定量，ΔCt=基因 Ct-內參照 Ct，ΔΔCt=實驗組Ct-對照組Ct。

3 統計學處理

運用SPSS 18.0 軟件進行分析，數據以均數±標準差（mean±SD）表示。多組間均數比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD 法。以P＜0.05 為差異有統計學意義。

結 果

1 肝臟鏡下觀圖片

正常組小鼠肝小葉結構完整，肝細胞大小一致，細胞核居中，胞漿紅染，見圖1A、G；模型組小鼠肝細胞體積變大，大小不一，細胞核偏位，胞漿呈現疏松化和空泡脂肪變性現象，見圖1B、H；安化黑茶高劑量組小鼠肝小葉結構清晰，肝細胞核居中，胞漿呈現紅染，部分區域出現少量空泡變性現象，見圖1C、I；中劑量組小鼠肝臟輪廓清晰，肝細胞大小一致，細胞核居中，胞漿紅染，個別區域出現少量的空泡變性現象，見圖1D、J；低劑量組小鼠肝小葉結構基本完整，肝細胞大小基本一致，肝細胞空泡變性和胞漿疏松化的現象稍多，見圖E、K；阿托伐他汀組小鼠肝細胞大小不等，可見胞漿疏松化和大小不等的空泡脂肪變性現象，見圖1F、L。各組NAS見表2。

Figure 1.The microscopic changes of hepatic tissues in mice（HE staining）.A～F:scale bar=200 μm；G～L:scale bar=50 μm.A，G:control group；B，H:model group；C，I:high-dose Anhua dark tea group；D，J:mediumdose Anhua dark tea group；E，K:low-dose Anhua dark tea group；F，L:atorvastatin group.圖1 小鼠肝組織鏡下觀變化

表2 NAFLD活動度積分在各組間的比較Table 2.Comparison of NAFLD activity scores（NAS）among the 6 groups（Mean±SD. n=10）

2 肝臟肉眼觀圖片

正常對照組小鼠肝臟體積偏小，顏色暗紅色，見圖2A；模型組小鼠肝臟體積偏大，黃色油膩感嚴重，見圖2B；安化黑茶高劑量組小鼠體積增大，肝臟呈現暗紅色，油膩感較輕，見圖2C；中劑量組小鼠肝臟暗紅色，油膩感較輕，見圖2D；低劑量組肝臟體積增大，呈現黃色油膩感，見圖2E；阿托伐他汀組小鼠組肝臟體積增大，呈現黃色油膩感，見圖2F。

Figure 2.The visual changes of hepatic tissues in mice of different groups.A:control group；B:model group；C:high-dose Anhua dark tea group；D:mediumdose Anhua dark tea group；E:low-dose Anhua dark tea group；F:atorvastatin group.圖2 各組小鼠肝組織肉眼觀變化

3 肝臟轉氨酶水平

與空白組相比，模型組小鼠肝臟ALT 和AST 水平升高（P＜0.05）；與模型組相比，安化黑茶高、中、低劑量組和阿托伐他汀組ALT 和AST 水平降低（P＜0.05），其中中劑量組ALT 水平最低（P＜0.05）；阿托伐他汀組AST水平低于中劑量組（P＜0.05），中、低劑量組AST 水平無顯著差異（P＞0.05），高劑量組AST水平低于中劑量組（P＜0.05），見表3。

表3 小鼠肝組織中ALT和AST水平Table 3.The levels of hepatic ALT and AST in mice［U/（g protein）.Mean±SD. n=10］

4 氧化應激水平

與空白組相比，模型組小鼠肝臟SOD 和GSH-Px活性下降，MDA 含量升高（P＜0.05）；與模型組相比，安化黑茶高、中、低劑量組SOD 和GSH-Px活性升高，MDA 含量下降（P＜0.05）；與阿托伐他汀組相比，高劑量組SOD活性升高（P＜0.05），低劑量組GSH-Px活性稍低（P＜0.05），各劑量組其余指標與他汀組相比無顯著差異（P＞0.05）；與中劑量組相比，低劑量組SOD 和GSH-Px 活性稍低，MDA 含量稍高（P＜0.05），高劑量組 SOD 活性升高（P＜0.05），GSH-Px 活性和MDA含量無顯著差異（P＞0.05），見表4。

表4 小鼠肝臟氧化應激相關指標Table 4.The levels of hepatic oxidative stress indicators in mice（Mean±SD. n=10）

5 脂類物質合成相關指標

5.1 HMGCR mRNA 表達 與模型組相比，安化黑茶不同劑量組和阿托伐他汀組小鼠肝臟HMGCR 的mRNA 表達都顯著降低（P＜0.05），其中他汀組和中劑量組最低（P＜0.05）；中劑量組與他汀組相比無顯著差異（P＞0.05），高、低劑量組高于中劑量組（P＜0.05），見表5。

5.2 SCD-1 mRNA 表達 與模型組相比，安化黑茶不同劑量組小鼠肝臟SCD-1 的mRNA 表達都顯著降低（P＜0.05），其中高、中劑量組最低（P＜0.05）；阿托伐他汀組表達高于中劑量組（P＜0.05），低劑量組高于中劑量組（P＜0.05），高劑量組與中劑量組相比無顯著差異（P＞0.05），見表5。

5.3 PPAR-γ 的 mRNA 表達 與模型組相比，安化黑茶不同劑量組和阿托伐他汀組小鼠肝臟PPAR-γ mRNA 表達降低（P＜0.05）；高、中劑量組低于他汀組（P＜0.05），各劑量組之間無顯著差異（P＞0.05），見表5。

表5 各組小鼠肝臟HMGCR、SCD-1和PPAR-γ的mRNA表達Table 5.The mRNA levels of hepatic HMGCR，SCD-1 and PPAR-γ in mice（Mean±SD. n=10）

討 論

減少外源性脂類物質的攝入、抑制內源性脂類物質的過度合成、促進脂類物質的轉運和分解對于防止脂類物質在肝臟的沉積起著重要作用。從病理形態學來看，ApoE-/-小鼠預防性灌胃給藥可很好地減輕肝臟脂變程度，我們前期研究已證實安化黑茶灌胃組小鼠血清中TG 含量低于模型組。肝臟中沉積的脂質主要是TG，內源性酯類物質合成的增加是誘發NAFLD 的關鍵因素。SCD-1是脂肪酸代謝過程中的關鍵限速酶，廣泛存在于各種組織中，其中以脂肪組織和肝組織中居多，在脂肪酸的合成代謝過程中發揮著重要的作用［15-16］。本研究發現安化黑茶組小鼠肝臟SCD-1 的mRNA 表達顯著低于模型組，有可能是由于NAFLD 形成過程中伴隨著胰島素抵抗的現象［17-18］，減弱了胰島素對脂蛋白脂酶（lipoprotein lipase，LPL）的激活作用，而LPL的減少導致TG無法被水解，引起高脂血癥的發生，而過多脂類物質的產生促使肝臟SCD-1 表達增加，加速了脂肪酸的合成，從而導致NAFLD 的發生。而安化黑茶可能通過減輕胰島素抵抗而增強了胰島素對于LPL 的激活作用，使TG 被水解，血脂含量有所降低，而脂類物質的減少也抑制了SCD-1表達，使肝臟脂變程度減輕。

HMGCR 作為與膽固醇代謝密切相關的轉錄因子及其代謝酶，可促進膽固醇的合成，從而誘發脂肪肝的形成。本研究顯示，各用藥組小鼠肝臟HMGCR的mRNA 表達顯著低于模型組，其中他汀組和黑茶中劑量組最低。他汀類藥物為HMGCR抑制劑，因此這一結果說明安化黑茶中可能有類他汀的成分，安化黑茶可以通過下調HMGCR 表達而起到抑制膽固醇合成的效果。

PPAR-γ 與肥胖、糖尿病、胰島素抵抗及其代謝綜合癥等疾病的發生和轉歸密切相關［19］。PPAR-γ在動物的脂肪組織中表達最為豐富［20-21］，可以促使游離脂肪酸在脂肪細胞的沉積，因此PPAR-γ是生脂過程的標志性因子。當肝細胞由于脂類沉積誘發脂肪變性后，肝臟中的PPAR-γ 表達便會顯著升高，大量PPAR-γ 表達促使脂質合成基因的激活，導致肝臟更多脂質的沉積［22-23］。若能夠去除肝細胞內或者巨噬細胞內的PPAR-γ，則可以有效避免小鼠肝臟脂肪變性［24］。本研究的結果和上述文獻一致，由此我們推測可能是由于高脂飲食促使肝臟PPAR-γ 出現高表達，過多脂類物質的攝入導致外周游離脂肪酸含量的增加，從而激活PPAR-γ信號并誘導其下游脂肪酸轉位酶（fatty acid translocase，FAT）的表達，FAT促使肝細胞攝取更多的脂肪酸，過多脂肪酸攝入超過了肝臟自身氧化的能力，最終誘導了肝細胞脂肪變性的發生。安化黑茶預防性給藥可以通過下調肝臟PPAR-γ 的mRNA 表達而減少脂類物質在肝臟沉積，從而達到很好的預防非酒精性脂肪肝的效果。

肝細胞的氧化損傷是誘發NAFLD 的重要因素之一。SOD 活性的高低間接反映了機體清除氧自由基的能力，過量的MDA 具有潛在的細胞毒性，是評價細胞損傷程度的重要指標，GSH-Px 可維持細胞膜結構的完整，因此可通過檢測SOD、MDA 和GSH-Px這3 個指標來推測機體抗氧化的情況［25］。本研究結果顯示，模型組小鼠肝臟中SOD 和GSH-Px 活性降低，MDA 含量升高，反映了在NAFLD 模型小鼠確實存在氧化損傷狀況；安化黑茶不同劑量組預防性給藥均可以提高肝臟SOD 和GSH-Px 活性，降低MDA含量及ALT 和AST 活性，說明安化黑茶預防性給藥可以起到抗氧化作用，從而減少對肝細胞的氧化損傷。

綜上所述，安化黑茶可能通過抑制脂類物質的合成、減少肝臟的氧化損傷來達到防治NAFLD 的效果。但是脂質轉運和分解異常也與NAFLD 的發生密切相關，我們在后續實驗過程中將檢測影響脂類物質轉運和分解的相關指標并進行深入分析。