TSTA3在食管鱗癌中的表達及作用*

牛 霞， 張曉娟， 高迎真， 卞 琳， 張 玲

（山西醫科大學基礎醫學院病理教研室，山西太原030001）

食管癌的發病率和死亡率分別居全球各種腫瘤類型的第8 位和第6 位［1］。在我國其組織學類型以鱗狀細胞癌（簡稱“鱗瘤”）為主，占90%以上，發病率和死亡率居于惡性腫瘤的第3 位和第4 位［2-3］。食管鱗癌（esophageal squamous-cell carcinoma，ESCC）早期的癥狀不明顯，亦無明確的診斷標志物，確診時已處于中晚期，目前食管癌的治療方式以手術為主，但預后較差，5年生存率僅有15%～25%［4-5］。因此，研究食管鱗癌的發病機制，明確其早期診斷標志物及治療靶點對于改善患者預后至關重要。

越來越多的文獻報道，異常巖藻糖基化在腫瘤生物學的各個方面發揮著重要作用，例如腫瘤細胞的增殖、侵襲和遷移、血管生成、轉移、免疫逃避等［6］。在結直腸癌、乳腺癌、肝癌、肺癌、黑色素瘤等腫瘤中都存在異常巖藻糖基化，且異常巖藻糖基化可作為多種腫瘤的診斷標志物［7］。巖藻糖基化是指將巖藻糖從GDP-L-巖藻糖轉移到糖蛋白或糖脂中某些蛋白質或N-和O-連接的聚糖等底物的過程。作為巖藻糖唯一供體的GDP-L-巖藻糖，其合成包括從頭合成和補救合成兩條途徑；其中，從頭合成途徑合成了人體內90%的GDP-L-巖藻糖；該途徑的限速酶為 GDP-4-酮-6-脫氧甘露糖-3，5 異構酶-4-還原酶（GDP-4-keto-6-deoxymannose-3，5-epimerase-4-reductase；又稱tissue specific transplantation antigen P35B，TSTA3）；該酶負責將GDP-D-甘露糖轉變為GDP-L-巖藻糖［8］。

本課題組前期對104 例食管鱗癌及其配對正常組織樣本進行了全基因組測序（whole genome sequencing，WGS）和全外顯子組測序（whole exome sequencing，WES），發現TSTA3基因存在2%的錯義突變頻率［9］，其定位于8q24.3，所在的區域存在顯著重復的拷貝數擴增［10］，說明TSTA3 與食管鱗癌的發生發展密切相關，但是TSTA3 在食管鱗癌中的表達及其作用尚不明確。本研究通過一系列的體外實驗探索TSTA3 在食管鱗癌中的表達和生物學功能，并探究其對食管鱗癌巖藻糖基化修飾的影響。

材 料 和 方 法

1 臨床標本

45 例ESCC 患者手術切除的食管鱗癌組織和距離腫瘤至少5 cm以上的配對癌旁組織收集于山西醫科大學附屬腫瘤醫院，石蠟包埋組織，并選擇合適組織制備組織芯片作為研究對象。此研究通過山西醫科大學及山西醫科大學附屬腫瘤醫院倫理委員會的審核。所有病例包括:男性33 例，女性12 例；年齡≥60 歲的有 27 例，＜60 歲的有 18 例；TNM 分期 I～II 患者 23 例，III～IV 患者 22 例；有淋巴轉移患者 22 例（N1 有 13 例，N2 有 5 例，N3 有 4 例），無淋巴轉移（N0）患者23例。術前均未進行放、化療等治療。

2 細胞

本實驗所用的人食管鱗癌細胞系KYSE180、KYSE450、KYSE150、KYSE410、KYSE510、ECA109和TE-1 均由山西醫科大學轉化醫學中心食管癌發病機理及轉化研究中心重點實驗室保存。

3 主要試劑和儀器

兔抗人TSTA3 多克隆抗體購自Abcam；鼠抗人β-actin 多克隆抗體購自北京全式金生物技術有限公司；熒光素（fluorescein）標記的扁豆凝集素（Lens culinarisagglutinin，LCA）購 自 Vector Laboratories；RPMI-1640 培養基、0.25%胰蛋白酶和胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）購自HyClone；MTT 和二甲基亞砜購自Sigma；TSTA3 過表達慢病毒LV13-Homa TSTA3（NM_003313）和陰性對照慢病毒LV13 negative control（LV13 NC）購自吉瑪基因。光學顯微鏡購自Olympus；自動酶標儀購自BioTek。

4 主要方法

4.1 免疫組化實驗 取石蠟切片常規脫蠟；行抗原修復；PBST 洗脫3 次；4℃孵育I 抗過夜；室溫復溫1 h，PBST 洗脫3 次；37℃孵育 II 抗 20 min；PBST 洗脫4 次后進行DAB 顯色；蘇木素復染；用梯度乙醇及二甲苯進行脫水；中性樹脂進行封片；通過ScanScope?AT 病理掃描系統（Aperio）進行免疫組化切片掃描，并利用ImageScope 圖像分析軟件（Aperio）分析組織樣本中TSTA3 蛋白表達情況，根據染色深淺自動計算出組織化學評分（histochemistry score，H-score），即代表TSTA3蛋白表達水平。

4.2 細胞培養 人食管鱗癌細胞系KYSE180、KYSE450、KYSE150、KYSE410、KYSE510、ECA109和TE-1 均采用含10% FBS 的RMPI-1640 培養基培養，置于5%CO2、37℃、100%濕度的細胞培養箱中培養，根據細胞狀態更換培養液，當細胞長至80%～90%融合度時進行傳代。

4.3 慢病毒感染 提前1 d 在96 孔板中接種KYSE150 細胞和 KYSE450 細胞；待第 2 天融合度達50%～70%時，加入已經稀釋好的不同MOI 梯度的慢病毒稀釋液；12～24 h 后，移去感染細胞的病毒液體，加入0.2 mL 完全培養基，繼續培養；根據細胞狀態及融合度，將細胞消化轉移到24 孔板，加入嘌呤霉素，篩選穩定過表達TSTA3 的KYSE150 和KYSE450細胞系，命名為TSTA3 over-expression（TSTA3-OE），感染陰性對照病毒LV13 NC 的細胞為NC 組。利用qPCR和Western blot檢測過表達效率。

4.4 qPCR 實驗 收集新鮮的細胞沉淀，提取RNA，反轉錄成cDNA，以GAPDH 為內參照，采用qPCR 法檢測 TSTA3 的 mRNA 表達量。用 2-ΔΔCt法計算目的基因的相對表達量。反應體系為:TB Green Premix Ex Taq 12.5 μL，三蒸水10.5 μL，ROX 0.5 μL，cDNA模板1 μL，上、下游引物各1 μL。根據GeneBank 中相應基因序列及Primer Premier 5 軟件設計特異性擴增引物。GAPDH 的上游引物序列為5'-CCAGAACATCATCCCTGCCT-3'，下游引物序列為5'-CCTGCTTCACCACCTTCTTG-3'；TSTA3 的上游引物序列為5'-CGTCATCCATCTTGCTGCAA-3'，下游引物序列為5'-AGGTCGTCTTGTCAGGGAAG-3'。

4.5 Western blot實驗 收取新鮮的細胞沉淀，提取總蛋白；BCA 法測蛋白濃度；蛋白變性及制備蛋白樣品；SDS-PAGE 分離2～3 h；利用PVDF 膜轉膜2 h；5%脫脂牛奶室溫封閉PVDF 膜1 h；4℃孵育兔抗人TSTA3 抗體（1∶500）及鼠抗人β-actin 抗體（1∶2 000）過夜；TBST 洗膜3次，室溫孵育HRP 標記的Ⅱ抗（1∶2 000）2 h；TBST洗膜4次，ECL化學發光顯影。

4.6 MTT 實驗 每組細胞消化后以每孔3 000 個接種于96 孔板，每孔培養液的最終體積為200 μL，分別在培養 24、48、72 和 96 h 后每孔加入 20 μL MTT（5 g/L）溶液；培養箱中放置4 h 后吸去培養液，加入200 μL 二甲基亞砜，室溫搖床孵育15 min，采用酶標儀直接檢測每孔的吸光度（A）；根據每組細胞的A值繪制折線圖，比較每組細胞的活力。

4.7 集落形成實驗 消化各組細胞，每孔接種500個細胞于6 孔板中，加入2 mL 含10% FBS 的完全培養基；培養7～14 d 后，用4%多聚甲醛固定20 min，結晶紫染色30 min；顯微鏡下觀察并計數有效集落數（≥50個細胞的團塊結構為1個集落）。

4.8 Transwell 實驗 細胞侵襲實驗:在Transwell 小室中加入100 μL 基礎培養基稀釋的Matrigel（BD）；消化各組細胞，小室中加入5×104個細胞，上室加入200 μL 基礎培養基，下室加入 600 μL 含 10%FBS 的完全培養基，置于37℃、5% CO2的培養箱中培養；24 h 后用4%多聚甲醛固定20 min，結晶紫染色30 min，觀察穿過小室底部膜的細胞，拍照并計數。細胞遷移實驗與上述侵襲實驗操作流程大致相同，只是去掉其中的Matrigel處理和預鋪設。

4.9 流式細胞術檢測LCA 消化各組細胞，PBS 清洗細胞沉淀；加入不同濃度的fluorescein 標記的LCA，室溫避光孵育1 h；離心，1%多聚甲醛重懸細胞沉淀，固定20 min；上機檢測各組細胞的熒光強度。

5 統計學處理

采用SPSS 19.0 軟件進行統計學分析。實驗結果均采用均數±標準差（mean±SD）表示。兩組間均數比較采用Student'st檢驗。以P＜0.05 為差異有統計學意義。

結 果

1 TSTA3在食管鱗癌組織中的表達

免疫組化結果顯示，TSTA3主要在胞漿中表達，其在癌旁組織和食管鱗癌組織中的表達量分別為13.08±18.74 和52.21±40.26，TSTA3 在食管鱗癌組織中的表達顯著高于癌旁組織（P＜0.01），見圖1。

Figure 1.The expression of TSTA3 in ESCC tissues（immunohistochemical staining，×200）.Mean±SD. n=45.**P＜0.01 vs adjacent group.圖1 TSTA3在食管鱗癌組織中的表達情況

2 過表達 TSTA3 的 KYSE150 和 KYSE450 細胞構建成功

利用qPCR 檢測 KYSE180、KYSE450、KYSE150、KYSE510、KYSE410、ECA109 和 TE-1 細胞中 TSTA3的mRNA 表達情況，并選擇TSTA3 內源性低表達的KYSE150 細胞和 KYSE450 細胞感染 TSTA3 過表達慢病毒，通過qPCR 和Western blot 檢測過表達效率，結果顯示，與相應的陰性對照組相比，KYSE150 細胞和KYSE450 細胞感染慢病毒后，TSTA3 的mRNA和蛋白表達水平均顯著升高（P＜0.01），見圖2。

Figure 2.TSTA3 was successfully over-expressed in KYSE150 and KYSE450 cells.A:the mRNA levels of TSTA3 in ESCC cell lines；B，C:qPCR and Western blot were used to detect the over-expression efficiency of TSTA3 in KYSE150 and KYSE450 cells after infection with lentivirus.Mean±SD. n=3.**P＜0.01 vs KYSE150 NC group；##P＜0.01 vs KYSE450 NC group.圖2 KYSE150和KYSE450細胞中TSTA3過表達成功

3 TSTA3對食管鱗癌細胞增殖能力的影響

MTT實驗結果顯示，與對照組相比，TSTA3過表達后 24、36、48、72 和 96 h，KYSE150 和 KYSE450 細胞活力的差異均無統計學顯著性（P＞0.05），見圖3A；集落形成實驗結果顯示，與對照組相比，KYSE150 和 KYSE450 細胞過表達 TSTA3 后集落形成能力的差異亦無統計學顯著性（P＞0.05），見圖3B。這表明TSTA3 不影響食管鱗癌細胞的增殖能力。

4 TSTA3對食管鱗癌細胞遷移和侵襲能力的影響

Transwell 實驗結果顯示，KYSE150 細胞 NC 組和TSTA3-OE 組的遷移細胞數分別為87±10 和203±16，侵襲細胞數分別為 60±27 和180±17；KYSE450 細胞NC 組和TSTA3-OE 組的遷移細胞數分別為37±5和89±3，侵襲細胞數分別為37±7 和79±6；2 種細胞TSTA3-OE 組遷移和侵襲細胞數與相應的NC 組相比均顯著增多（P＜0.01），見圖4。這提示TSTA3 過表達可促進食管鱗癌細胞的遷移和侵襲。

5 TSTA3 對食管鱗癌細胞核心巖藻糖基化水平的影響

流式細胞術結果顯示，KYSE150 細胞NC 組和TSTA3-OE組的熒光強度分別為 96.00±4.55 和121.03±7.01；KYSE450 細胞 NC 組和 TSTA3-OE 組的熒光強度分別為66.71±3.58 和93.62±3.34；2 種細胞TSTA3-OE組熒光強度與相應的NC組相比均顯著升高（P＜0.05 或P＜0.01），見圖5。這提示在食管鱗癌細胞中過表達TSTA3可以提高細胞核心巖藻糖基化修飾水平。

Figure 3.The effects of TSTA3 over-expression on the viability（A）and colony formation ability（B）of ESCC cells.Mean±SD. n=5.圖3 TSTA3過表達對ESCC細胞活力和集落形成能力的影響

Figure 4.The effects of TSTA3 over-expression on the migration and invasion abilities of ESCC cells were detected by Transwell assays（×100）.Mean±SD. n=5.**P＜0.01 vs KYSE150 NC group；##P＜0.01 vs KYSE450 NC group.圖4 TSTA3過表達對ESCC細胞遷移和侵襲能力的影響

Figure 5.The effect of TSTA3 over-expression on core fucosylation modification of ESCC cells.Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs KYSE150 NC group；##P＜0.01 vs KYSE450 NC group.圖5 TSTA3過表達對ESCC細胞系核心巖藻糖基化修飾的影響

討 論

蛋白質糖基化是一種重要的蛋白質功能性修飾，在細胞黏附、受體激活、腫瘤侵襲和轉移及炎癥反應等多種細胞過程中發揮重要作用［11-14］。巖藻糖基化是糖基化的修飾方式之一，在ABO血型抗原、宿主-微生物間的相互作用、選擇素介導的白細胞外滲、淋巴細胞歸巢等生物學過程中發揮重要作用，其中GDP-L-巖藻糖是巖藻糖基化的重要中間產物，是巖藻糖基化的唯一供體。TSTA3是GDP-L-巖藻糖從頭合成途徑的限速酶［15］。

基于本課題組前期食管鱗癌組織及配對正常組織的組學測序，我們發現巖藻糖/甘露糖代謝通路在I期病例中的突變頻率顯著高于III 期，TSTA3基因編碼該通路的限速酶，且TSTA3基因所在的區域存在顯著且重復的拷貝數擴增，說明TSTA3 與食管癌發生發展密切相關［16-17］。

在結直腸癌、肝細胞癌、乳腺癌和非小細胞肺癌等腫瘤中均存在TSTA3 的表達增高。在結直腸癌，干擾TSTA3表達可導致選擇素配體——唾液酸化Lewis a 抗原的表達下調，降低了細胞對活化人臍靜脈內皮細胞和E-選擇素的黏附能力，并降低對細胞外基質和纖連蛋白的黏附，與腫瘤轉移相關［18］；在乳腺癌，腫瘤組織中TSTA3 的表達與乳腺癌患者的TNM 分期相關，且TSTA3高表達的患者預后較差，是一個獨立的預后因素，并且在乳腺癌細胞中敲除TSTA3可引起CXCR4、CXCL12、MMP9等基因的表達下調，說明TSTA3與腫瘤細胞的侵襲能力相關［19］。

本研究中，免疫組化結果顯示，TSTA3 在ESCC組織中顯著高表達，且過表達TSTA3 可以明顯促進ESCC 細胞的侵襲和遷移能力，提示TSTA3基因在ESCC 中發揮癌基因作用。LCA 屬于豆科凝集素家族，是一種核心巖藻糖結合凝集素，可特異性結合核心巖藻糖基化蛋白質，長期以來被用作特異性探針［20］。我們利用LCA 作為特異性探針，發現TSTA3過表達可以提高ESCC 細胞核心巖藻糖基化修飾水平，提示TSTA3 參與調節ESCC 核心巖藻糖基化修飾。

在肝細胞癌和非小細胞肺癌，TSTA3 誘導的GDP-L-巖藻糖和核心巖藻糖基化水平升高，說明TSTA3 可能作為腫瘤的潛在診斷標志物［21-22］；另外，6-炔基-巖藻糖（6-alkynyl-fucose，6-Alk-Fuc）是一種巖藻糖基化探針，也是巖藻糖基化抑制劑，通過阻斷FX 酶（由TSTA3基因編碼）介導的巖藻糖基化，消耗GDP-巖藻糖，抑制巖藻糖基化，從而抑制肝癌細胞的侵襲和遷移，但對增殖沒有影響［23］。因此，TSTA3可能通過調節巖藻糖基化修飾在ESCC 中發揮促進腫瘤細胞侵襲和遷移的作用。本研究為靶向TSTA3藥物和巖藻糖基化抑制劑在ESCC 治療中的作用提供了一定的理論基礎。