右美托咪定術中干預對老年小鼠圍術期神經認知障礙的影響及其可能機制*

于文華， 孟馥芬， 姜莉莉， 閆 睿， 劉亞華

（新疆醫科大學附屬腫瘤醫院麻醉科，新疆烏魯木齊830011）

圍術期神經認知障礙（perioperative neurocognitive disorders，PND）是指圍術期患者的認知功能變化，在老年（＞60歲）患者的發生率遠大于非老年的成年患者，且隨著年齡的增大而增高［1-2］。PND 導致的注意力、精神狀態和意識水平的變化多出現在術后早期到術后數月［3］，并可能持續影響患者生活質量和疾病預后，甚至導致老年癡呆的發生［4］。降低老年患者術后認知功能障礙的發生率，在延長其生命的同時改善其生存質量是手術預后面臨的挑戰。PND 的病因尚未明確，誘因較多，臨床表現復雜，治療手段有限，并往往被醫護人員忽視，得不到及時的確診和有效的干預［5］。

右美托咪定（dexmedetomidine，DEX）與其它通過下丘腦腹外側視前區（ventrolateral preoptic region，VLPO）神經元環路下游γ-氨基丁酸受體發揮作用的鎮靜藥物不同，是通過VLPO調節覺醒以發揮鎮靜作用的麻醉輔助藥物［6］。DEX 可在神經系統遭受創傷時抑制機體的炎癥反應，減少氧化應激反應并調節細胞凋亡［7］。也有研究報道，DEX 可降低老年患者術后認知功能障礙［8］，但其具體機制并不清楚。因此，本研究建立PND 小鼠模型，探討術中DEX 干預對老年小鼠術后認知功能的改善作用及其機制，以期為今后DEX應用于老年患者手術的麻醉過程提供參考資料。

材 料 和 方 法

1 儀器與器材

DEX 注射液購于江蘇恒瑞醫藥股份有限公司；RIPA 裂解液、BCA 蛋白定量試劑盒、焦油紫染液、抗β-肌動蛋白（β-actin）抗體、生物素標記的II 抗、辣根過氧化物酶標記的鏈霉卵白素、辣根過氧化物酶標記的II抗和一步法TUNEL染色試劑盒（綠色熒光）購于上海碧云天生物技術有限公司；抗膠質細胞原纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic portein，GFAP）抗體購自Sigma；抗白細胞介素6（interleukin-6，IL-6）抗體購自Novus；抗腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）和 cleaved caspase-3 抗體購自 Abcam。

2 實驗動物、手術模型及分組處理

60 只 14 月齡 SPF 級雄性 C57BL/6J 小鼠（體重28～32 g）購自新疆醫科大學動物實驗中心［SCXK（新）2018-0001］并飼養在SPF 級動物房［SYXK（新）2018-0003］中，小鼠可自由進食進水。所有實驗開展前，小鼠均在飼養環境下適應1 周。小鼠被隨機分為假手術（sham）組、手術（surgery）組和DEX 干預組（DEX 組），每組20 只小鼠。左肝外葉切除術組小鼠通過術前吸入0.3%異氟烷麻醉，在術中利用0.1%異氟烷0.3 L/min 維持麻醉，并進行左肝外葉切除術；DEX 干預組小鼠在手術組的基礎上，在術中增加DEX（15 μg/kg，腹腔注射）［9］；假手術組麻醉方式同手術組，僅開腹，但不進行左肝外葉切除術。術后1～3 d 注射青霉素預防切口感染，術后2 周小鼠進行后續行為學實驗。術后小鼠無死亡現象。

3 方法

3.1 Morris 水迷宮實驗 通過水迷宮裝置（直徑120 cm，高50 cm；ACT-200A 型，Coulbourn）對小鼠進行Morris 水迷宮測試。注入水（恒溫25℃，水深25 cm），調整平臺低于水面1 cm，小鼠被放置在一個隨機的象限中。實驗開始前1 d訓練小鼠站臺，隨后在實驗開始的1～5 d記錄小鼠找到平臺的時間（逃避潛伏期），并在第6 天沉降平臺至水池底部，記錄小鼠在平臺所在象限的停留時間及第1 次進入平臺所在象限所用時間。實驗期間保持安靜無人的實驗環境。采用裝置自帶視頻跟蹤軟件輸出小鼠的運動軌跡。

3.2 Y迷宮實驗 通過Y迷宮實驗裝置（水平三臂，長 30 cm，寬 6 cm，高 15 cm，各臂夾角為 120°；RD1102-YM-M 型，上海移數信息科技有限公司）統計小鼠自發交替率研究其空間認知能力。將小鼠放置任意一個臂末端，通過自帶攝像裝置記錄10 min內小鼠進入各個臂的順序。一個自發的交替被定義為連續選擇進入3 個不同的區域。每只小鼠實驗結束后，用清水徹底清洗迷宮，去除殘留的氣味，然后進行下個小鼠實驗。

3.3 電生理記錄 在行為學實驗結束后，每組任取10只小鼠，斷頸，快速取出完整腦組織并迅速置于O2和CO2混合的切片液中并切取35 μm 腦片，隨后迅速轉移至氧飽和的人工腦脊液（NaCl 124 mmol/L，KH2PO41.25 mmol/L，KCl 2.69 mmol/L，MgSO42 mmol/L，CaCl22 mmol/L，NaHCO326 mmol/L，葡萄糖10 mmol/L）中。用微分干涉相差顯微鏡（DMi8-M型，Leica）觀察海馬并找到CA1 區。以Axoclamp-2B膜片鉗給予刺激，記錄場興奮性突觸后電位（field excitatory postsynaptic potential，fEPSP）以反映長時程增強（long-term potentiation，LTP），取1/3 fEPSP 最大反應刺激作為基線刺激強度，基線至少記錄10 min，記錄時連續用O2和CO2飽和的人工腦脊液灌流。

3.4 小鼠腦組織分離 在行為學實驗結束后，將每組剩余的10 只小鼠通過腹腔注射戊巴比妥鈉（50 mg/kg）麻醉，快速取出完整腦組織，在冰上快速分離出雙側海馬組織。海馬組織分成3 部分，一部分直接凍存在-80℃冰箱用于后續Western blot 檢測，另一部分用于制作石蠟組織并切成6 μm 厚度石蠟切片；最后一部分用制作冰凍組織并切成8 μm 厚度冰凍切片。

3.5 尼氏染色 石蠟腦片經常規脫蠟至水后，用1%焦油紫30 min。自來水沖洗1 min，70%乙醇分化30 s，常規脫水、透明、封片后，在顯微鏡（DSX510型，Olympus）下觀察，并隨機選取5 個視野拍照，用ImageJ軟件對尼氏體計數。

3.6 免疫組化染色 石蠟腦片經常規脫蠟至水后，用 3% 的 H2O2處理 5 min，PBS 浸泡 5 min，用 0.01 mmol/L枸櫞酸鹽緩沖液抗原修復。用10%山羊血清在37℃下封閉腦片1 h 后，滴加I 抗（抗GFAP 抗體，1∶500）并在37℃下孵育2 h，PBS沖洗腦片2次，每次5 min，滴加生物素標記的II抗（1∶200）并在37℃孵育20 min，PBS沖洗腦片2次，每次5 min，滴加辣根過氧化物酶標記的鏈霉卵白素（1∶200）并在37℃孵育20 min，PBS 沖洗腦片 2 次，最后以 DAB 溶液顯色 5 min，自來水沖洗 2 min。在顯微鏡（DSX510 型，Olympus）下觀察，并隨機選取5 個視野拍照，通過ImageJ軟件統計陽性信號。

3.7 免疫熒光實驗 在室溫下，用0.5% Triton X-100 溶液處理冰凍腦片2 min，用10%山羊血清在37℃下封閉1 h 后，滴加I抗（抗NeuN 抗體，1∶1 500）孵育2 h。PBS 沖洗腦片2 次，每次5 min，滴加FITC標記的II 抗（1∶500），暗室室溫孵育1 h。在熒光顯微鏡（Q-PHASE 型，TESCAN）下觀察，隨機選取5 個視野，通過ImageJ軟件統計陽性信號。

3.8 TUNEL 染色 在室溫下，用4%多聚甲醛溶液固定冰凍腦片10 min，PBS 沖洗腦片2 次，每次5 min，用 0.5% Triton X-100 溶液處理 2 min，PBS 沖洗腦片2次，每次5 min，滴加50 μL TUNEL檢測液并在暗室室溫孵育1 h。并用DAPI 復染5 min，在熒光顯微鏡（Q-PHASE 型，TESCAN）下觀察，隨機選取5 個視野，用ImageJ軟件對TUNEL陽性細胞計數。

3.9 Western blot 用RIPA 裂解液裂解海馬組織并提取全蛋白，蛋白用BCA 法定量，取40 μg 蛋白樣品進行電泳并電轉移至PVDF膜。以5%脫脂牛奶室溫下封閉1 h，隨后加I抗（抗GFAP 抗體，1∶2 000；抗βactin 抗體，1∶4 500；抗 IL-6、TNF-α 和cleaved caspase-3 抗體，1∶1 000）4℃孵育過夜。TBST 洗膜2 次，每次10 min，室溫孵育 HRP 標記的 II 抗 1 h，TBST 洗膜 2次，每次5 min，暗室ECL 法顯影于膠片。膠片進行掃描后，以β-actin為參照，用ImageJ軟件量化目的蛋白表達。

4 統計學處理

數據表示為均數±標準誤（mean±SEM），使用SPSS 20.0 軟件對數據進行分析。多組數據之間比較采用單因素方差分析及Bonferroni 校正的t檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 右美托咪定對老年小鼠術后認知行為的影響

各組小鼠在Morris 水迷宮實驗中的運動軌跡見圖1A。與假手術組比較，手術組小鼠在Morris 水迷宮實驗第2～5 天的逃避潛伏期顯著延長（P＜0.01），在Morris 水迷宮實驗第6 天滯留于平臺所在象限的時間顯著縮短（P＜0.01），且首次進入平臺所在象限的潛伏期顯著延長（P＜0.01）；與手術組比較，DEX干預組小鼠在Morris 水迷宮實驗第2～5 天的避潛伏期顯著縮短（P＜0.01），在Morris水迷宮實驗第6天滯留于平臺所在象限的時間顯著延長（P＜0.01），且首次進入平臺所在象限的潛伏期顯著縮短（P＜0.01），見圖1B～D。在Y 迷宮實驗中，與假手術組比較，手術組小鼠自發性交替率顯著降低（P＜0.01）；DEX 干預組小鼠自發性交替率較手術組小鼠顯著升高（P＜0.01），見圖1E。

2 右美托咪定對老年小鼠術后海馬神經元的保護作用

尼氏染色結果顯示，手術組小鼠海馬CA1 區單位面積內尼氏染色陽性細胞數相比于假手術組顯著減少（P＜0.01），而術中DEX 干預可顯著逆轉這些改變（P＜0.01），見圖2A。NeuN 免疫熒光結果顯示，DEX 干預組海馬NeuN 陽性細胞數相比于手術組顯著增加（P＜0.01），見圖2B。

3 右美托咪定對老年小鼠術后海馬LTP的影響

通過膜片鉗記錄小鼠海馬CA1 區LTP，實驗結果顯示，在突觸前給予高頻電刺激后，相比于假手術組，手術組小鼠單個刺激引起的突觸后誘發電位幅度降低，DEX 干預組電位幅度基本與假手術組相近；通過統計，DEX 干預組fEPSP 斜率顯著高于手術組（P＜0.01），見圖3。

Figure 1.Effects of dexmedetomidine（DEX）on postoperative cognitive behavior in aged mice.A:water maze trajectory maps；B:escape latency in water maze experiment；C:residence time in the quadrant of platform in water maze experiment；D:exploration latency in water maze experiment；E:Y maze spontaneous alternation rate.Mean±SEM. n=20.##P＜0.01 vs sham group；**P＜0.01 vs surgery group.圖1 右美托咪定對老年小鼠術后認知行為的影響

Figure 2.Protective effect of dexmedetomidine（DEX）on hippocampal neurons in aged mice after operation.A:Nissl staining results of hippocampal CA1 region；B:immunofluorescence results of NeuN protein in hippocampal CA1 region.Scale bar=50 μm.Mean±SEM. n=10.##P＜0.01 vs sham group；**P＜0.01 vs surgery group.圖2 右美托咪定對老年小鼠術后海馬神經元的保護作用

Figure 3.Effect of dexmedetomidine（DEX）on long-term potentiation（LTP）in hippocampus of aged mice after operation.A:diagrams of LTP changes in hippocampal CA1 region；B:scatter plot of field excitatory postsynaptic potential（fEPSP）slope at different time points.Mean±SEM. n=10.##P＜0.01 vs sham group；**P＜0.01 vs surgery group.圖3 右美托咪定對老年小鼠術后海馬LTP的影響

4 右美托咪定對老年小鼠術后海馬星形膠質細胞活化的影響

與假手術組比較，手術組小鼠海馬星形膠質細胞增多，GFAP 表達水平顯著升高（P＜0.001）；與手術組比較，DEX 干預組小鼠海馬星形膠質細胞減少，GFAP 表達水平顯著降低（P＜0.01），見圖4A、B。TUNEL 染色結果顯示，手術組小鼠海馬TUNEL 陽性染色神經元顯著增多（P＜0.01），而DEX 干預可顯著降低老年小鼠術后海馬神經元凋亡率（P＜0.01），見圖4C。

5 右美托咪定對老年小鼠術后海馬組織炎癥因子和凋亡因子的影響

Western blot實驗結果顯示，與假手術組相比，手術組小鼠海馬組織TNF-α、IL-6 及cleaved caspase-3的蛋白水平顯著升高（P＜0.01），而DEX 干預能顯著降低上述蛋白水平（P＜0.01），見圖5。

討 論

PND 是老年患者術后常見的并發癥之一［1-3，8］。PND 的發生是多種因素造成的，主要與膽堿能系統、神經遞質、氧化應激及炎癥細胞因子有關［10］。對PND 避免和防范是臨床老年患者手術過程中亟待解決的問題。本研究在C57BL/6J老年小鼠左肝外葉切除術中給予DEX 干預，并利用Y 迷宮和水迷宮評價動物記憶情況。其中Y 迷宮測試可區分工作記憶和參考記憶情況；而水迷宮中的穿越原平臺位置次數反映工作記憶中對獲取有效信息的能力和記憶的保持能力。本研究的行為學結果顯示，手術組小鼠工作記憶發生障礙；與手術組比較，DEX 干預組工作記憶錯誤次數明顯減少，總錯誤次數明顯減少，穿臺次數明顯增加，表明術中DEX 干預可顯著改善老年小鼠術后認知功能。LTP 是評價學習記憶及突觸可塑性的常用生理指標。本研究通過膜片鉗技術記錄了術中DEX 干預對老年小鼠海馬CA1 區LTP 的影響，結果顯示術中DEX干預可顯著逆轉術后引起的突觸后電位幅度減小。

DEX 可以改善老年患者全麻術后認知功能［8，11］，但其具體機制仍不明晰。已有研究通過對行下脛骨骨折內固定術的老年小鼠的血腦屏障和海馬進行檢測發現，小鼠術后表現為血腦屏障破壞和海馬受損［12］。海馬受損將導致認知功能障礙［13-14］。海馬位于大腦丘腦和內側顳葉之間，屬于邊緣系統的一部分，在記憶和認知等方面有重要作用，尤其與短時記憶以及對環境的感知有著非常明確的關系［15］。已有研究表明，在老年小鼠創傷術后海馬神經元會發生丟失和凋亡，海馬神經元創傷是認知功能障礙發生的關鍵步驟［16］。本研究結果顯示，術中DEX 干預可明顯逆轉手術導致的老年小鼠海馬神經元丟失和凋亡。手術創傷應激可導致小膠質細胞和星形膠質細胞的活化以及海馬組織促炎因子TNF-α 和IL-1β 生成增多［17-18］。小膠質細胞和星形膠質細胞的活化和神經炎癥是誘導PND 發生的必要條件［17-18］。因此，我們進一步思考術中DEX干預對術后老年小鼠認知功能的改善是否與星形膠質細胞活化有關。本研究通過免疫熒光、免疫組化和Western blot 實驗證實了術中DEX干預可抑制手術后老年小鼠星形膠質細胞活化及炎癥因子TNF-α和IL-6的生成。

Figure 4.Effects of dexmedetomidine（DEX）on the activation of hippocampal astrocytes in aged mice after operation.A:immunohistochemical staining for GFAP in hippocampus of aged mice；B:Western blot results of GFAP protein in hippocampus of aged mice；C:TUNEL immunofluorescence staining results and apoptotic rate analysis.Scale bar=50 μm.Mean±SEM. n=10.##P＜0.01 vs sham group；**P＜0.01 vs surgery group.圖4 右美托咪定對老年小鼠術后海馬星形膠質細胞活化的影響

Figure 5.Effects of dexmedetomidine（DEX）on the levels of inflammatory and apoptotic factors in hippocampal tissues of aged mice after operation.Mean±SEM. n=10，##P＜0.01 vs sham group；**P＜0.01 vs surgery group.圖5 右美托咪定對老年小鼠術后海馬組織炎癥因子和凋亡因子的影響

綜上所述，本研究證明了術中DEX 干預可抑制海馬星形膠質細胞活化、神經炎癥及神經元凋亡，從而保護海馬神經元，達到改善老年小鼠術后認知功能的作用。