三七總皂苷抑制缺氧缺糖/復氧復糖誘導的SH-SY5Y細胞焦亡*

唐 標， 唐文靜， 戴姿薇， 佘 旭， 鄧常清

（湖南中醫藥大學醫學院，長沙湖南410028）

腦缺血再灌注損傷作為缺血性腦卒中的重要環節，其損傷機制與線粒體功能障礙、氧化應激、興奮性毒性、凋亡、炎癥等多因素有關［1-2］。細胞焦亡（pyroptosis）作為一種炎癥相關的細胞死亡方式，參與了腦缺血再灌注中的炎癥反應。當細胞焦亡啟動后，gasdermin D（GSDMD）作為細胞焦亡的執行分子，其被活化后的GSDMD N 端片段（GSDMD N-terminal fragment，GSDMD-N）會形成聚合物并與細胞膜上的脂質分子形成孔道，導致細胞腫脹破裂，釋放大量促炎因子，加重炎癥反應［3］。已有研究表明，腦缺血再灌注誘導細胞焦亡，抑制細胞焦亡能減輕腦缺血再灌注損傷，細胞焦亡成為腦缺血再灌注損傷干預的重要靶點［4-6］。

三七是治療心腦血管疾病的名貴中藥，三七總皂苷（Panax notoginsengsaponins，PNS）是三七的主要有效成分，含多種單體皂苷，其制劑如血栓通注射液、血塞通注射液等在心腦血管疾病的防治中被廣泛應用［7-8］。已有大量的研究揭示PNS及其有效成分具有抗炎、抗血栓、抗氧化、抗動脈粥樣硬化、抑制腦神經細胞凋亡、促進血管新生、減輕腦缺血損傷等多方面的作用，但是其對細胞焦亡的調控作用和機制還不明確［9-11］。因此，本研究采用缺氧缺糖/復氧復糖（oxygen-glucose deprivation/reoxygenation，OGD/R）構建體外腦缺血再灌注SH-SY5Y 細胞模型，觀察PNS對OGD/R 誘導的SH-SY5Y 細胞焦亡的影響，探討PNS 對OGD/R 誘導的SH-SY5Y 細胞焦亡的調控機制。

材 料 和 方 法

1 材料

1.1 細胞株 人神經母細胞瘤細胞系SH-SY5Y 購于中國科學院上海細胞生物學研究所。

1.2 藥物及主要試劑 PNS（中國成都曼斯特生物科技有限公司，批號MUST-14122912，純度≥98%）；高糖 DMEM 和無糖DMEM 培養液（Gibco）；CCK-8 試劑盒（大連美侖生物技術有限公司）；兔抗人caspase-1、caspase-4 和 GSDMD 單克隆抗體（Cell Signaling Technology）；鼠抗人β-actin 單克隆抗體（Sigma）；山羊抗兔II 抗和山羊抗鼠II 抗（Merck Millipore）；人白細胞介素 1β（interleukin-1β，IL-1β）ELISA 檢測試劑盒、細胞凋亡與壞死檢測試劑盒和乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）細胞毒性檢測試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司）；人IL-18 ELISA 檢測試劑盒（上海嵐派生物科技有限公司）；兔抗人caspase-1 前體（procaspase-1）多克隆抗體和鼠抗人caspase-4前體（procaspase-4）單克隆抗體（Proteintech）。

1.3 主要儀器 CO2培養箱（長沙奇美儀器有限公司）；自動酶標儀（BioTek）；電泳儀、轉膜儀和凝膠成像系統（Bio-Rad）；缺氧培養氣室MC-101 和混合氣閥（Billups-Rothenberg）。

2 方法

2.1 細胞培養 細胞用含10%胎牛血清和雙抗的高糖DMEM 培養液，放置于37℃、5% CO2培養箱中培養。根據細胞生長狀況，待細胞匯合度為90%左右時，用0.25%的胰蛋白酶消化收集細胞并傳代，取對數生長期的細胞用于實驗。

2.2 SH-SY5Y 細胞OGD/R 模型的建立 參照文獻［12］，各組 OGD/R 預處理的細胞，以無糖 DMEM 培養液輕輕沖洗一遍，每孔加入37℃預熱的無糖DMEM 培養液，放入缺氧培養氣室中，持續通入95%N2和5% CO2的混合氣體，1.5 L/min，持續6 min，以保證缺氧培養氣室內缺氧環境的穩定和完全，通氣結束后，關閉缺氧培養氣室，放于培養箱中培養2 h；OGD處理結束后，各組細胞換回高糖DMEM培養液，并于37℃、5%CO2培養箱中繼續培養，進行復氧復糖24 h。

2.3 細胞活力檢測 取生長狀態良好、匯合度為90% 的 SH-SY5Y 細胞，接種于 96 孔板，每孔 1×104個細胞，在37℃、5%CO2培養箱中，用含10%胎牛血清的高糖DMEM 培養液培養4 h。待細胞貼壁后，棄去原培，加入無血清培養液，培養24 h。同步化后，再棄原液，加入含藥培養液100 μL（PNS濃度參照文獻選擇40、80、160、320、640 和1 280 mg/L［10-11］），同時設置不含藥物、含培養液和細胞的空白對照（control）組，干預24 h。24 h 之后棄去原培養液，加含10%CCK-8 的培養液100 μL，另設空白孔（不含細胞，只含10%CCK-8的培養液）。在37℃、5%CO2培養箱中孵育1 h 后，用酶標儀檢測其在450 nm 處的吸光度（absorbance，A）。實驗每組設置6 個復孔，重復3次。細胞相對活力（%）=（樣品平均A值-空白孔平均A值）/（空白對照組平均A值-空白孔平均A值）×100%。

另一實驗設空白對照組、OGD/R 處理組及PNS干預組，亦進行細胞活力檢測。各組細胞經接種培養、同步化后，空白對照組不做處理繼續正常培養，OGD/R 處理組及PNS 干預組進行OGD 處理。OGD處理2 h后，OGD/R 處理組換以高糖DMEM 培養液進行復氧復糖24 h；PNS 干預組換以含PNS（根據細胞活力檢測部分結果選擇無顯著細胞毒性的濃度:40、80、160和320 mg/L）的高糖DMEM 培養液進行復氧復糖24 h。各組中任何一組的任何一次換液，空白對照組也均平行換液，以排除換液對細胞損傷的影響。復氧復糖結束后進行CCK-8 實驗，檢測方法和分析同上。實驗重復3次。

2.4 LDH 漏出率檢測 各組細胞接種于96 孔板中，試驗設空白對照組、OGD/R 處理組及PNS 干預組，同時設空白孔（不接種細胞，只加培養液），空白對照組設6 個復孔，其他組每組設置3 個復孔，各組處理方式同前。處理結束后，選取空白對照組中的3個復孔加入10 μL LDH 釋放試劑，作為樣品細胞最大酶活性對照孔，其他組每孔加入10 μL 培養液，繼續于培養箱中培養1 h后，將細胞培養板用多孔板離心機400×g離心5 min。分別取各孔的上清液60 μL，加入到新的96 孔板相應孔中，各孔再分別加入60 μL LDH 檢測工作液，輕輕混勻后，室溫避光孵育30 min，在490 nm處測定A值。LDH漏出率（%）=（樣品平均A值-空白孔平均A值）/（細胞最大酶活性孔平均A值-空白孔平均A值）×100%。實驗重復3次。

2.5 Hoechst 33342/碘化丙啶（propidium iodide，PI）染色檢測 Hoechst 33342是一種可以穿透細胞膜并結合DNA 的藍色熒光染料，可通過完整的細胞膜而使細胞核顯藍光；PI是一種可以嵌合到雙鏈DNA 和RNA 的堿基對中并與之結合的熒光染料，無堿基特異性，僅能通過受損的細胞膜而使細胞核顯紅光。各組細胞接種于24 孔板，每孔1×105個細胞，分組和處理同前。處理后各孔加入5 μL Hoechst 33342 染色液和5 μL PI染色液，混勻，于4℃染色20 min，熒光顯微鏡下觀察，隨機選取3 個非重疊的視野，計數每個視野中的細胞總數及紅色熒光細胞數，參照文獻計算PI 陽性細胞比例［13］。PI 陽性細胞比例（%）=紅色熒光細胞數/細胞總數×100%。每組設置3 個復孔，實驗重復3次。

2.6 Western blot 檢測焦亡相關蛋白 各組細胞接種于6 孔板內，每孔5×105個細胞，分組和處理同前。處理結束后去上清，用預冷PBS 洗1 次，每孔加含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的裂解液50 μL，冰上裂解30 min，邊裂解并用移液槍輕柔吹打，促進細胞裂解。裂解后，4℃、2 400×g離心10 min，取出含有組織總蛋白的上清液。加上樣緩沖液后于沸水浴加熱10 min，以使蛋白充分變性。經電泳、轉膜、封閉，將膜與 I 抗［GSDMD（1∶1 000）、caspase-1（1∶1 000）、caspase-4（1∶1 000）、procaspase-1（1∶500）、procaspase-4（1∶500）和β-actin（1∶5 000）抗體］置于4℃孵育過夜，用 TBST 緩沖液洗膜后，將II 抗（1∶10 000 稀釋）與膜于室溫搖床上孵育60 min。ECL 顯色曝光，用Quantity One 灰度分析軟件進行圖像定量分析，計算目的蛋白積分吸光度（integrated absorbance，IA）與內參照蛋白IA的比值，以此表示蛋白相對含量。每組設置3個復孔，實驗重復3次。

2.7 ELISA 法檢測細胞培養上清 IL-1β 和 IL-18 含量 細胞接種于24 孔板，分組和處理同前。處理結束后，細胞培養上清100×g離心5 min，取上清，按照試劑盒說明書進行檢測。試劑盒于室溫下平衡20 min后，將樣品或稀釋好的不同濃度標準品按照每孔100 μL 加入相應孔中，每孔設置1 個復孔。同時設置本底校正孔，即空白孔，設置方法為該孔只加TMB溶液和終止液。用封板膜封住反應孔，室溫孵育120 min后，洗板5次，且最后一次置于厚吸水紙上拍干；每孔加入生物素化抗體100 μL，封孔后室溫孵育60 min，洗板5 次；每孔加入辣根過氧化物酶標記的鏈霉親和素100 μL，室溫避光孵育20 min，洗板5次；每孔加入TMB顯色液100 μL，室溫避光孵育20 min；每孔加入終止液50 μL，混勻后立即在450 nm 處測定A值。根據標準品濃度和A值繪制標準曲線，通過樣品A值和標準曲線計算樣品濃度。

3 統計學處理

使用SPSS 22.0 軟件進行統計分析。所有數據為計量資料，均以均數±標準差（mean±SD）表示。服從正態分布的多組間均數比較采用單因素方差分析，兩兩比較方差齊時采用最小顯著差異（least significant difference，LSD）法，方差不齊時采用Dunnett法；若不服從正態分布，則采用秩和檢驗。以P＜0.05為差異具有統計學意義。

結 果

1 PNS提高OGD/R誘導的SH-SY5Y細胞活力

CCK-8 結果顯示，40、80、160 及320 mg/L 的PNS對細胞活力無明顯影響（P＞0.05），說明該濃度范圍的 PNS 無細胞毒性，640 及 1 280 mg/L 的 PNS 顯著降低細胞活力（P＜0.01），因此選擇≤320 mg/L 的濃度進行后續實驗；此外，OGD/R處理后的SH-SY5Y細胞活力顯著降低（P＜0.01），而80、160 及320 mg/L 的PNS顯著提高OGD/R 處理后的SH-SY5Y 細胞活力（P＜0.05或P＜0.01），40 mg/L的PNS對OGD/R處理后的SH-SY5Y 細胞活力無明顯影響（P＞0.05），因此選擇80、160及320 mg/L的PNS進行后續實驗，見圖1。

2 PNS 降低 OGD/R 誘導的 SH-SY5Y 細胞 LDH 漏出率

OGD/R 處理后的 SH-SY5Y 細胞 LDH 漏出率顯著升高（P＜0.01），而 80、160 及320 mg/L 的PNS 干預能顯著降低OGD/R 處理后的SH-SY5Y 細胞LDH 漏出率（P＜0.05或P＜0.01），見圖2。

Figure 1.The effect of PNS on the viability of SH-SY5Y cells.Mean±SD. n=3.**P＜0.01 vs control group； #P＜0.05，##P＜0.01 vs OGD/R group.圖1 PNS對SH-SY5Y細胞活力的影響

Figure 2.The effect of PNS on the LDH leakage of SH-SY5Y cells.Mean±SD. n=3.**P＜0.01 vs control group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs OGD/R group.圖2 PNS對SH-SY5Y細胞LDH漏出率的影響

3 PNS 降低 OGD/R 誘導的 SH-SY5Y 細胞 PI 染色陽性細胞比例

Hoechst 33342/PI 染色結果顯示，control 組少見紅色熒光，OGD/R 處理后的SH-SY5Y 細胞紅色熒光增加，PI 陽性細胞顯著增加（P＜0.01）；與OGD/R 組比較，PNS 組細胞紅色熒光減少，PI 陽性細胞顯著減少（P＜0.01），見圖3。

4 PNS降低OGD/R誘導的SH-SY5Y細胞GSDMD和GSDMD-N蛋白表達

Western blot 結果顯示，與 control 組比較，OGD/R組細胞GSDMD 和GSDMD-N 蛋白表達顯著增加（P＜0.01）；與 OGD/R 組比較，PNS 組 GSDMD 和 GSDMDN蛋白表達顯著降低（P＜0.01），見圖4。

5 PNS 降低 OGD/R 誘導的 SH-SY5Y 細胞 caspase-1和caspase-4蛋白表達

Western blot 結果顯示，與 control 組比較，OGD/R處理后的 SH-SY5Y 細胞 procaspase-1、procaspase-4、caspase-1 和caspase-4 蛋白表達顯著增加（P＜0.01）；與 OGD/R 組比較，PNS 組細胞 caspase-1 和 caspase-4蛋白表達顯著降低（P＜0.05 或P＜0.01），但procaspase-1 和procaspase-4 蛋白的表達無顯著變化（P＞0.05），見圖5。

6 PNS抑制OGD/R誘導的SH-SY5Y細胞IL-1β和IL-18分泌

ELISA 結果顯示，與 control 組比較，OGD/R 組細胞培養上清中 IL-1β 和 IL-18 含量顯著增加（P＜0.01）；與 OGD/R 組比較，PNS 組細胞培養上清中IL-1β和IL-18含量顯著降低（P＜0.05 或P＜0.01），見圖6。

討 論

OGD/R 是構建腦缺血再灌注體外模型的常用方法［14-15］。本研究以 OGD/R 誘導的 SH-SY5Y 細胞構建腦缺血再灌注體外模型，探討PNS 對OGD/R 誘導的細胞焦亡的調控作用和機制，結果顯示，OGD/R 誘導的SH-SY5Y 細胞活力明顯降低，而PNS 干預能顯著提高OGD/R 誘導SH-SY5Y 細胞活力。前期有大量體內、體外研究探討PNS 在腦缺血再灌注中的保護作用，其結果均表明PNS 能減輕腦缺血再灌注損傷［9-11］。

細胞焦亡是一種炎癥相關的細胞死亡方式，介導了腦缺血再灌注損傷的發生和發展過程［16］，因此本研究從細胞焦亡途徑探討PNS 抗腦缺血再灌注損傷機制。細胞焦亡的主要特征為細胞膜穿孔，通透性變大，細胞焦亡執行蛋白GSDMD 被活化［3］。本研究結果顯示OGD/R 誘導的SH-SY5Y 細胞LDH 漏出率明顯升高，PI染色紅色熒光增強，PI陽性細胞比例明顯升高，表明細胞膜通透性增加，同時結果顯示OGD/R 誘導的SH-SY5Y 細胞GSDMD 蛋白及其主要活化產物GSDMD-N 的表達明顯增加，這與已有研究結果一致［4］，再結合OGD/R 可誘導原代星形膠質細胞和 PC12 細胞焦亡的報道［5，17］，表明 OGD/R 可誘導SH-SY5Y細胞焦亡。而PNS干預后LDH漏出率明顯降低，PI染色紅色熒光減弱，PI陽性細胞比例顯著降低，細胞GSDMD 蛋白及其主要活化產物GSDMD-N的表達明顯減少，結合抑制GSDMD 可以抑制細胞焦亡、減輕腦缺血再灌注損傷的報道［4-5］，提示PNS可能通過抑制細胞焦亡減輕OGD/R 誘導的SH-SY5Y 細胞損傷。

Figure 3.The effect of PNS on SH-SY5Y cells with Hoechst 33342/PI staining.A:Hoechst 33342/PI staining in SH-SY5Y cells of each group（scale bar=50 μm）；B:the percentage of the PI positive cells to total cells.Mean±SD. n=3.**P＜0.01 vs control group；##P＜0.01 vs OGD/R group.圖3 PNS對SH-SY5Y細胞Hoechst 33342/PI染色的影響

Figure 4.The effect of PNS on protein expression of GSDMD and GSDMD-N in SH-SY5Y cells.Mean±SD. n=3.**P＜0.01 vs control group；##P＜0.01 vs OGD/R group.圖4 PNS對SH-SY5Y細胞GSDMD和GSDMD-N蛋白表達水平的影響

Figure 5.The effect of PNS on protein expression of caspase-1 and caspase-4 in SH-SY5Y cells.The protein levels of procaspase-1，caspase-1，procaspase-4 and caspase-4 in each group were detected by Western blot.Mean±SD. n=3.**P＜0.01 vs control group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs OGD/R group.圖5 PNS對SH-SY5Y細胞caspase-1和caspase-4蛋白表達水平的影響

Figure 6.The effect of PNS on the levels of IL-1β（A）and IL-18（B）in the supernatants.Mean±SD. n=3.**P＜0.01 vs control group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs OGD/R group.圖6 PNS對SH-SY5Y細胞培養上清中IL-1β和IL-18含量的影響

GSDMD 的 活 化 由 caspase-1/4/5/11 介 導 ，caspase-4/5 為小鼠 caspase-11 在人體中的同源蛋白［18］。本研究進一步觀察了PNS對OGD/R 誘導的SH-SY5Y細胞 caspase-1、caspase-4、procaspase-1 和 procaspase-4 表達的影響，結果顯示 OGD/R 誘導的 SH-SY5Y 細胞 caspase-1、caspase-4、procaspase-1 和 procaspase-4的表達明顯增加，這與已有研究報道一致［19］，表明OGD/R 可誘導 caspase-1 和 caspase-4 活化。而 PNS干預對procaspase-1 和procaspase-4 的表達無顯著影響，但顯著降低caspase-1 和caspase-4 的表達，提示PNS 干預能抑制OGD/R 誘導的SH-SY5Y 細胞caspase-1 和caspase-4 活化。已有研究證實，在小鼠腦缺血再灌注中存在caspase-1 和caspase-11 的活化，抑制其活化可減輕腦缺血再灌注損傷［19-20］，提示PNS可能通過抑制caspase-1 和caspase-4 的活化而抑制OGD/R誘導的SH-SY5Y細胞焦亡。

此外，caspase-1 和caspase-11 的活化將剪切IL-1β 和 IL-18 的前體，生成 IL-1β 和 IL-18，細胞焦亡發生導致細胞膜損傷，IL-1β和IL-18被釋放［3］。本研究結果顯示OGD/R 處理后的SH-SY5Y 細胞培養上清中 IL-1β 和 IL-18 含量顯著增加，而 PNS 干預后細胞細胞培養上清中IL-1β 和IL-18 含量顯著降低，表明PNS 能抑制 OGD/R 誘導的 SH-SY5Y 細胞 IL-1β 和 IL-18的釋放。

已有研究報道，OGD/R 能誘導細胞焦亡［4］。本研究結果揭示OGD/R 誘導SH-SY5Y 細胞焦亡，并且PNS 能抑制 caspase-1、caspase-4 和 GSDMD 的剪切活化，從而抑制OGD/R誘導的SH-SY5Y細胞焦亡。

綜上所述，OGD/R 可誘導SH-SY5Y 細胞焦亡，PNS 能減輕 OGD/R 誘導的 SH-SY5Y 細胞損傷，其機制與抑制細胞焦亡以及IL-1β和IL-18的釋放有關。