HET0016對LPS誘導大鼠小膠質細胞增殖和遷移的抑制作用研究*

許 燕， 舒仕瑜

（1重慶醫科大學附屬兒童醫院麻醉科，2重慶醫科大學附屬第二醫院麻醉科，重慶400000）

小膠質細胞（microglia）是中樞神經系統內的巨噬細胞，一直以來被認為是大腦中樞神經系統抵御病原入侵的第一道防線［1］。在正常的大腦內，小膠質細胞能不斷運動，執行多種功能，例如突觸調節、吞噬凋亡的細胞碎片、防御感染等。當組織發生損傷時，小膠質細胞會遷移到損傷部位周圍，發揮屏障作用［2］。但是在腦缺血、感染等病理狀態下，小膠質細胞可被迅速激活，活化的小膠質細胞將釋放多種炎癥因子，包括腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細胞介素 1β（interleukin-1β，IL-1β）、白細胞介素6（interleukin-6，IL-6）等，從而誘導周圍細胞損傷。已有研究表明，活化的小膠質細胞在中樞神經系統損傷（如神經退行性疾病［3］、腦出血［4］等）中起著重要的作用。因此，抑制小膠質細胞的活化并減少炎癥因子釋放，對緩解神經系統損傷炎癥反應有重要意義［5］。

花生四烯酸（arachidonic acid，AA）代謝網絡調節著機體的細胞分化、增殖、激素分泌、凝血及纖溶系統動態平衡等生理過程。20-羥二十烷四烯酸（20-hydroxyeicosatetraenoic acid，20-HETE）是AA 的代謝產物，其水平上升對于炎癥反應、氧化應激、心血管疾病發生等都有重要意義［6］。HET0016 是 20-HETE合成酶的抑制劑，研究證實HET0016 可減小小鼠腦梗死局灶性缺血的體積，并改善神經功能評分，其機制與增強 Na+-K+-ATP 酶活性有關［7］。此外，有實驗證明，HET0016可通過抑制 MMP-9 表達、JNK 通路和氧化應激以激活緊密連接蛋白的表達，從而減輕實驗性創傷后腦水腫，發揮保護腦屏障功能［8］。但是HET0016 是否能在調節小膠質細胞增殖和遷移中發揮作用，目前并不清楚。

核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）是一種快反應因子，以無活性的形式廣泛存在于多種組織和細胞中，被激活以后參與基因的轉錄調控［9］。近年來的研究顯示，NF-κB 活化與神經系統疾病如阿爾茨海默病（Alzheimer disease，AD）、帕金森病（Parkinson disease，PD）等［10］的發生有密切的聯系。此外，在小膠質細胞中，NF-κB 激活可通過核移位而參與調節炎癥因子的基因表達，而阻斷NF-κB 所介導的炎癥反應很可能是修復中樞神經相關損傷的途徑之一［11］。本研究通過分離、培養原代小膠質細胞，觀察HET0016 對小膠質細胞活力及遷移的影響，進一步檢測小膠質細胞內炎癥因子TNF-α 和IL-1β 的表達水平及NF-κB 信號通路中p50 和p65 兩種蛋白的表達情況，為探究小膠質細胞炎癥反應的機制提供參考資料。

材 料 和 方 法

1 儀器和試劑

HET0016（Sigma）；抗 CD11b、p50 和 p65 抗體（Abcam）；DMEM/F12 培養液、PBS 和0.25%胰蛋白酶（HyClone）；胎牛血清（Gibico）；CCK-8 試劑盒（Dojindo）；20-HETE ELISA 試劑盒（上海生工）；TNF-α 和IL-1β ELISA 試劑盒（北京欣博盛生物科技有限公司）。

2 主要方法

2.1 小膠質細胞的原代培養 取出生24 h 內SD 大鼠放入75%乙醇中進行浸泡消毒，取出小鼠并轉移至無菌干凈的平皿中，用剪刀剪開顱骨，取出腦組織，剪去腦干后置于D-Hanks 洗液中清洗，去除血污后轉移至新的盛有D-Hanks 洗液的無菌培養皿中，仔細去除腦組織表面腦膜和血管（盡量在15 min 內完成）。將剝離完血管膜的組織放入預置有1 mL 解剖液的青霉素小瓶中，用顯微剪剪碎（＜1 mm×1 mm×1 mm），加入2 滴DNA 酶和1 mL 胰酶（胰酶終濃度為0.125%），于37℃孵箱中孵育15 min。結束后取出小瓶，將液體轉移至離心管中，并加5 mL 完全培養液，900×g離心 5 min 棄上清，重懸在 5 mL 無血清培養液中，轉移至75 cm2培養瓶中，加入10 mL 完全培養液（37℃預熱）。5% CO2、37℃培養箱培養5 d，全量換液，以后每3 d半量換液。

2.2 小膠質細胞的分離純化 待原代細胞培養到9～14 d 時，細胞充分分層生長，用封口膜封閉培養瓶瓶口，將培養瓶置于37℃恒溫振蕩搖床上，在160×g下震蕩6 h，收集上清至無菌離心管中，400×g離心8 min，棄上清，加入4 mL 無血清培養液輕輕吹打重懸，均勻滴加于24孔培養板的中央4個孔中，于孵箱中培養半小時使小膠質細胞貼壁，取出，吸出上清，再向每個孔加1 mL 培養液，所得細胞可用于細胞純度鑒定及下一步實驗。

2.3 免疫熒光細胞化學染色 取種于載玻片中的小膠質細胞，PBS 洗3 次，每次5 min。加入4%多聚甲醛進行固定，20 min 后用PBS 清洗三次，每次5 min。用0.1%Triton X-100進行破膜處理，一共3次，每次5 min。將載玻片置于濕盒內，加入5%山羊血清，室溫封閉30 min。加入抗CD11b 抗體（1∶200）于4℃過夜孵育。將載玻片從濕盒中取出，PBS 洗3 次，每次5 min。加入Goat anti-Rat IgG H&L（1∶1 000）置于濕盒內，室溫孵育30 min。用PBS 洗3 次，每次5 min。DAPI（1∶2 000）染核10 min。PBS洗3次，每次5 min，用免疫熒光防淬滅劑封片，晾干后置于熒光顯微鏡下觀察。

2.4 細胞實驗分組 取小膠質細胞，分為對照（control）組（培養液+細胞）、脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）組（50 μg/L LPS+培養液+細胞）、HET0016 組（1 μmol/L HET0016+培養液+細胞）和LPS+HET0016 組（50 μg/L LPS+1 μmol/L HET0016+培養液+細胞）；其中LPS 和HET0016 的處理時間均為24 h，共處理時先用LPS處理24 h，再用HET0016處理24 h。

2.5 流式細胞術檢測S 期細胞比例 處理結束后，將小膠質細胞離心收集，用300 μL 含10%胎牛血清的PBS 重懸，轉移至新的1.5 mL 的EP 管中，加入0.7 mL 無水乙醇，于4℃固定過夜；次日，將EP 管于500×g離心 1 min 后，加入 1 mL PBS 重懸細胞，再加入400 μL 50 mg/L PI，避光孵育10 min，用流式細胞術分析S期細胞比例。

2.6 CCK-8 法檢測細胞活力 將小膠質細胞制備成細胞懸液，以每孔100 μL（含約8 000 個細胞）細胞懸液接種于96 孔板，培養24 h 后，按照實驗分組在培養板加入不同濃度的待測物，處理結束后，根據試劑盒說明書進行操作，向每個孔加入CCK-8 工作液（100 μL 培養液+10 μL CCK-8 溶液），于37℃培養箱中孵育2 h 后，用酶標儀測定450 nm 處的吸光度（A）。細胞相對活力（%）=（實驗組A值-空白組A值）/（對照組A值-空白組A值）×100%。

2.7 細胞遷移實驗

2.7.1 Transwell 遷移實驗 將細胞消化離心后，用完全培養液重懸，進行細胞計數后，將細胞稀釋成為1×108/L 的細胞懸液；先向Transwell 板中加入500 μL的完全培養液，將小室放入板中；再向Transwell小室中加入 200 μL 的細胞懸液，將 Transwell 板放入細胞培養箱培養24 h；處理結束后，取出Transwell 小室，吸掉培養液，用PBS 清洗。最后用結晶紫溶液染色10 min，PBS 清洗去除多余染料后，置于顯微鏡下觀察并拍照，計算遷移細胞的數量。

2.7.2 細胞劃痕實驗 取適量小膠質細胞接種于6孔板中，待細胞長滿后，用200 μL吸頭垂直于培養板劃痕；用PBS 清洗細胞3 次，去除細胞碎片和未貼壁細胞，加入無血清培養液，立刻在顯微鏡下觀察，并拍攝劃痕區域圖像（即0 h）；繼續培養24 h 后，再次于同一區域進行觀察并拍攝（即24 h）。

2.8 ELISA 法檢測 20-HETE、TNF-α 和 IL-1β 的水平 將小膠質細胞接種于6孔板中，每孔約4×105個，并分為對照組、LPS 組、HET0016 組和 LPS+HET0016組，每組設3 個復孔，處理結束后收集細胞上清液進行后續檢測。按照20-HETE、TNF-α 和IL-1β 檢測試劑盒步驟進行測定，在酶標儀中于490 nm 波長處測定A值。繪制標準曲線，并根據曲線計算對應的濃度。

2.9 Western blot 檢測蛋白表達 依次提取各組細胞總蛋白，用BCA 法進行蛋白定量。制備用于SDSPAGE 的凝膠，每孔加入 40 μg 細胞總蛋白，90 V 電泳約30 min 后，調整電壓至120 V，電泳至溴酚藍到達玻璃板底部。取出凝膠，采用濕轉法于磚模夾子中210 mA 電泳2 h，蛋白可被轉到PDVF 膜上。轉膜結束后用5%牛血清白蛋白室溫下封閉1 h；TBST 清洗 3 次，每次 5 min；加入 I 抗（抗p50 和p65 抗體均按1∶1 000 稀釋），4℃孵育過夜；TBST 清洗3 次，每次5 min；加入II 抗，室溫孵育2 h；TBST 清洗 3 次，每次5 min；結束后加入顯色劑進行化學發光，在多功能凝膠成像系統下，觀察并拍照分析。

3 統計學處理

應用SPSS 17.0 軟件進行統計分析。計量資料以均數±標準差（mean±SD）表示，采用單因素方差分析進行組間比較，以P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 小膠質細胞的培養和純度鑒定

分離并培養原代小膠質細胞后，顯微鏡下可見小膠質細胞貼壁生長，單個細胞呈細長或橢圓形，從胞體發出兩個或多個突起，胞體形態清晰，生長附著良好，成團情況少見，見圖1A、B。進一步用免疫熒光法檢測小膠質細胞特異性表面抗原CD11b（呈綠色熒光），用DAPI 標記其胞核（呈藍色熒光）。結果顯示，視野內所見細胞均呈綠色熒光，證實所檢測的細胞為CD11b 陽性細胞，即為小膠質細胞，見圖1C、D。這說明通過本方法可獲得狀態良好、純度較高的小膠質細胞，可用于繼續培養并進行下一步實驗。

2 HET0016對LPS刺激后小膠質細胞活力的影響

CCK-8 結果顯示，與對照組相比，LPS 組小膠質細胞活力顯著提高（P＜0.01）；當 HET0016 濃度為0.5～1.5 μmol/L 時，小膠質細胞的活力顯著下降（P＜0.05）；當應用1 μmol/L 的HET0016處理小膠質細胞24～48 h 時，小膠質細胞活力相比于LPS 組也有所下降（P＜0.05），見圖2。因此在后續實驗中，HET0016處理小膠質細胞的濃度為1 μmol/L，處理時間為24 h。

Figure 2.HET0016 inhibited the viability of microglia induced by LPS.A:the effects of different concentrations of HET0016 on the viability of microglia；B:the viability of microglia after treated with 1 μmol/L HET0016 for different time.Mean±SD. n=3.*P＜0.05，**P＜0.01 vs control group；#P＜0.05 vs LPS group.圖2 HET0016抑制LPS誘導的小膠質細胞活力

3 HET0016對小膠質細胞上清液20-HETE 水平的影響

ELISA 結果顯示，與對照組相比，LPS 組小膠質細胞上清液 20-HETE 水平顯著上升（P＜0.05），HET0016 處理組20-HETE 水平顯著下降（P＜0.05）；與 LPS 組相比，LPS+HET0016 組 20-HETE 水平顯著下降（P＜0.05），見圖3。

4 HET0016對小膠質細胞S期比例的影響

Figure 3.The level of 20-HETE was decreased in the supernatant of microglia after HET0016 treatment.Mean±SD. n=3.*P＜0.05，**P＜0.01 vs control group；#P＜0.05 vs LPS group.圖3 HET0016下調小膠質細胞上清液20-HETE水平

流式細胞術結果顯示，對照組、HET0016組、LPS組和LPS+HET0016 組小膠質細胞S 期比例分別為36.19%、27.37%、43.8%和34.48%；與對照組相比，LPS 處理能夠增加 S 期細胞百分比（P＜0.05）；而與LPS 組相比，LPS+HET0016 組S 期細胞百分比下降，即HET0016 處理能降低S 期細胞百分比（P＜0.05），見圖4。

5 HET0016對小膠質細胞遷移的影響

Transwell實驗結果顯示，LPS組穿膜小膠質細胞數量較對照組顯著增多（P＜0.05）；與LPS 組相比，HET0016 組和LPS+HET0016 處理組穿膜細胞數量顯著減少（P＜0.05），見圖5A。細胞劃痕實驗結果顯示，LPS 組劃痕縮減面積顯著大于對照組（P＜0.05）；與 LPS 組相比，HET0016 組和 LPS+HET0016 組劃痕縮減面積顯著減小（P＜0.05），見圖5B。這2 個實驗結果一致，均說明HET0016 能抑制LPS 引起的小膠質細胞遷移。

6 HET0016 對小膠質細胞炎癥因子（TNF-α 和IL-1β）釋放的影響

ELISA 結果顯示，與對照組相比，LPS 組小膠質細胞上清液TNF-α和IL-1β水平顯著上升（P＜0.05）；與 LPS 組相比，HET0016 組和 LPS+HET0016 組小膠質細胞上清液 TNF-α 和 IL-1β 水平顯著下降（P＜0.05），見圖6。

7 HET0016 對小膠質細胞 NF-κB 通路 p50 和 p65蛋白表達的影響

Western blot 結果顯示，與對照組比較，LPS 組p50 和p65 蛋白表達水平顯著升高（P＜0.05）；與LPS組相比，HET0016 組和 LPS+HET0016 組 p50 和 p65蛋白表達量顯著下降（P＜0.05），見圖7。

Figure 4.HET0016 decreased the S-phase proportion in microglia induced by LPS.Mean±SD. n=3. *P＜0.05，**P＜0.01 vs control group；#P＜0.05 vs LPS group.圖4 HET0016降低LPS誘導的小膠質細胞S期比例

討 論

小膠質細胞是中樞神經系統主要的免疫細胞，介導中樞神經系統損傷的內源性免疫反應。有研究證實，LPS 可誘導小膠質細胞活化并大量釋放NO、TNF-α、IL-6 等炎癥因子，導致神經系統出現炎癥反應；與此同時，小膠質細胞的大量增殖將使得更多小膠質細胞被活化，從而加重神經系統的損傷［12］。而應用非甾體抗炎藥水楊酸甲酯糖苷處理LPS 刺激的小膠質細胞，可抑制小膠質細胞內炎癥因子IL-6 的釋放，且不同程度地抑制iNOS、COX-1和COX-2蛋白的表達，以緩解小膠質細胞內炎癥反應，進而對LPS刺激的小膠質細胞發揮保護作用［13-14］。因此，調控小膠質細胞增殖活化及炎癥反應對緩解神經系統的損傷有著重要意義。

Figure 5.HET0016 inhibited the migration of microglia exposed to LPS.A:results of Transwell assay；B:results of scratch wound healing assay.Scale bar=20 μm.Mean±SD. n=3.*P＜0.05，**P＜0.01 vs control group；#P＜0.05 vs LPS group.圖5 HET0016抑制LPS誘導的小膠質細胞遷移

Figure 6.HET0016 decreased the levels of TNF-α（A）and IL-1β（B）in the supernatant of microglia.Mean±SD. n=3.*P＜0.05，**P＜0.01 vs control group；#P＜0.05 vs LPS group.圖6 HET0016下調小膠質細胞上清液TNF-α和IL-1β水平

Figure 7.HET0016 decreased the protein expression of p50 and p65 in microglia.Mean±SD. n=3.*P＜0.05，**P＜0.01 vs control group；#P＜0.05 vs LPS group.圖7 HET0016下調小膠質細胞p50和p65蛋白表達水平

本實驗結果顯示，LPS可引起小膠質細胞增殖和遷移能力增強，炎癥因子IL-1β 和TNF-α 的水平均有所增加，這與文獻報道結果一致［15］。小膠質細胞的增殖和遷移能力增強將導致更多小膠質細胞被活化，釋放大量炎癥因子，其中，IL-1β 和TNF-α 都被證實參與了神經炎癥反應［13］。此外，本研究還檢測到LPS 能引起20-HETE 表達增加，而已有研究指出20-HETE的增加不僅與腦梗死的發生相關［16］，還可以通過激活NF-κB 促進血管內皮炎癥反應［17］。HET0016作為20-HETE 合成的特異性抑制劑，對20-HETE 的抑制效果比17-十八炔酸（17-octadecynoic acid，17-ODYA）和1-氨基苯并三唑（1-aminobenzotriazole，1-ABT）更為明顯，因此在很多由于20-HETE 失衡導致的神經系統疾病及心血管疾病中具有潛在價值［18-20］。本研究進一步探究HET0016 在LPS 刺激小膠質細胞中的作用，結果顯示，HET0016在有效降低20-HETE水平的同時，不僅抑制了小膠質細胞的增殖和遷移，還減少了LPS 所誘導的細胞內炎癥因子IL-1β 和TNF-α的釋放。與我們實驗結果相似的是，HET0016在其它疾病模型中也發揮了一定作用。有研究證實，HET0016 能抑制缺血/再灌注大鼠模型中的超氧陰離子的產生，減輕脂質過氧化程度，降低血腦屏障通透性，以減輕腦水腫［18］。而在紋狀體腦出血小鼠模型中，HET0016 可減少活化小膠質細胞和變性壞死神經元的數量，減小腦損傷體積，從而減輕腦出血后周圍神經的損傷［21］。而在本研究中，HET0016 可通過抑制小膠質細胞的活力和遷移能力，減少炎癥因子釋放，進而減輕小膠質細胞對機體的損傷。

NF-κB 轉錄因子廣泛存在于多種細胞中，激活后參與多種基因的轉錄調控，在中樞神經系統疾病的發生發展中有重要的意義。有研究顯示，雷公藤內酯可抑制小膠質細胞的活化，緩解神經系統損傷，其機制與下調 NF-κB 的表達有關［22］。另外，20-HETE 可通過激活NF-кB 通路，進一步對血管內皮細胞發揮氧化應激和促炎作用，參與心血管疾病的發生發展［23］。由于 NF-κB 以 p65/p50 異源二聚體發揮主要作用，因此本研究檢測了p50 和p65 蛋白的表達水平。結果顯示，LPS 處理后細胞內p50 和p65 蛋白的表達水平顯著上升，而HET0016 處理不僅下調細胞中p50 和p65 蛋白表達水平，且抑制LPS 所引起的p50 和p65 蛋白表達上調。此外，p65/p50 蛋白表達水平增加還見于急性腎損傷模型、食管鱗癌組織等［24-25］。張思思等［26］研究證實，羥基積雪草苷可以有效抑制LPS 刺激的小膠質細胞炎癥因子生成，其機制也與抑制 NF-κB 的表達有關，因此 NF-κB 可能是調控小膠質細胞炎癥反應的重要途徑之一。由于激活的NF-κB 需要轉移入核內才能發揮功能，因此盡管HET0016 處理引起的p50 和p65 蛋白表達水平下調可在一定程度上抑制NF-κB 通路的功能，但是其中的機制需要更深入的研究。

綜上所述，本研究結果顯示HET0016 能抑制LPS刺激的小膠質細胞增殖和遷移能力，減少炎癥因子的釋放，其發揮作用的途徑很可能與NF-κB 通路有關，然而更深入的作用機制有待進一步研究。