白藜蘆醇通過調節miR-223-3p/NLRP3通路發揮對幼年大鼠腦膜炎模型皮質神經元的保護作用*

高 蒙， 黃 娟

（重慶醫科大學基礎醫學院人體解剖學教研室，重慶400016）

新生兒細菌性腦膜炎（bacterial meningitis，BM）是新生兒期嚴重的急性感染性疾病，其發病率約占新生兒總數的0.2%～1.0%，在早產兒中則高達3%［1］。B 族溶血性鏈球菌（group B hemolyticStreptococcus，GBS）是新生兒腦膜炎的常見致病菌之一，GBS 感染引起的細菌性腦膜炎可導致約10%的患兒死亡，25%～35%的患兒留下嚴重的神經系統后遺癥［2］。細菌性腦膜炎的不良預后與炎癥因子釋放導致的神經元損傷密切相關［3］。神經元損傷的表現形式有凋亡、壞死、焦亡等［4-6］。細胞焦亡（pyroptosis）又稱為細胞炎性壞死，它是近年來發現的一種程序性細胞死亡方式，其特征為依賴于胱天蛋白酶1（caspase-1），并伴有白細胞介素 1β（interlukin-1β，IL-1β）和 IL-18 等炎癥因子的釋放［7］。有研究顯示細胞焦亡與細胞凋亡的發生密切相關［8］。目前，關于在新生兒細菌性腦膜炎模型中是否發生神經元焦亡的研究較少，針對此模型中神經元焦亡的作用，以及抑制焦亡對神經元凋亡的影響等問題，仍有待探討。

白藜蘆醇（resveratrol，Res）是一類存在于虎杖、葡萄、花生、桑葚等多種植物內的多酚類化合物［9］。目前有文獻報道白藜蘆醇具有廣泛的生物和藥理活性，對心血管、呼吸、神經等多個系統中的器官和細胞發揮抗氧化、抗凋亡、抗腫瘤等重要作用［10-12］。有研究顯示，在肺炎鏈球菌性大鼠腦膜炎模型中白藜蘆醇可抑制小膠質細胞的活化，在海馬區發揮抗炎和神經保護作用［13-14］。但白藜蘆醇對腦膜炎模型中皮質功能區的神經元是否具有保護作用則未見報道。

微小RNA（microRNA，miRNA，miR）是一類長度約為22 個核苷酸的非編碼小分子單鏈RNA，可通過與靶基因mRNA 互補結合而抑制靶基因的表達，從而發揮調控細胞增殖、分化、遷移等功能［15-16］。有文獻顯示在中樞神經系統中白藜蘆醇可通過調控miRNA 的表達水平發揮神經保護作用［13，17］。在細菌性腦膜炎模型中，白藜蘆醇能否通過調控miRNA 的表達水平發揮抗神經元焦亡和凋亡的作用值得研究。在本研究中，我們利用GBS 建立幼年大鼠腦膜炎模型，并針對此模型中白藜蘆醇是否通過調控miR-223-3p發揮神經保護作用進行了研究和探討。

材 料 和 方 法

1 實驗動物與分組

3周齡健康SD 大鼠64只（其中術中死亡4只，實驗中予以排除），雌雄不限，體重約50 g，由重慶醫科大學實驗動物中心供應，動物合格證號為SCXK（渝）2018-0003。大鼠飼養于安靜，通風和空氣過濾系統的環境中，自由攝食和飲水，室溫控制在（25±0.5）℃，相對濕度60%～70%，12 h 晝夜節律。動物實驗符合重慶醫科大學實驗動物倫理委員會制定的動物實驗標準。

為明確白藜蘆醇對大鼠腦膜炎損傷模型的最佳治療劑量，按照隨機數字表法，將大鼠隨機分為假手術（sham）組，模型（BM）組，以及白藜蘆醇低劑量（0.03 mg/kg）、中劑量（0.06 mg/kg）和高劑量（0.12 mg/kg）組；為確定最佳治療劑量的白藜蘆醇對大鼠腦膜炎模型神經功能、腦內炎癥反應及miR-223-3p表達的影響，按照隨機數字表法，將大鼠隨機分為sham 組、BM 組和白藜蘆醇治療（BM+Res）組；為明確miR-223-3p 與核苷酸結合寡聚化結構域樣受體蛋白3（nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3，NLRP3）之間的相互作用，按照隨機數字表法，將大鼠隨機分為BM+Res+antagomir 對照（BM+Res+antagomir control）組和 BM+Res+miR-223-3p antagomir組。

2 主要儀器與試劑

腦立體定位儀（深圳瑞沃德生命技術有限公司）；酶標儀（Thermo）；熒光定量PCR 儀、蛋白電泳儀和凝膠成像系統（Bio-Rad）；熒光顯微鏡（Olympus）。白藜蘆醇（Sigma）；miR-223-3p antagomir和antagomir陰性對照（RiboBio）；兔抗NLRP3 多克隆抗體、鼠抗NeuN 單克隆抗體、兔抗膠質細胞原纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）多克隆抗體、兔抗離子鈣結合銜接分子1（ionized calcium-binding adapter molecule 1，Iba1）單克隆抗體、兔抗IL-1β 多克隆抗體及兔抗IL-18 多克隆抗體（Abcam）；兔抗cleaved caspase-1（CC-1）多克隆抗體（Novus Biologicals）；兔抗β-actin單克隆抗體（武漢三鷹生物技術有限公司）；RIPA 裂解液、蛋白酶抑制劑、BCA 蛋白濃度測定試劑盒、TUNEL 細胞凋亡檢測試劑盒及HE染色試劑盒（碧云天生物技術有限公司）；FITC 標記的山羊抗兔IgG（北京中杉金橋生物技術有限公司）；HRP AffiniPure goat anti-rabbit IgG（H+L）和HRP AffiniPure goat anti-mouse IgG（H+L）購自 EarthOx Life Science；RNAIso Plus 試劑、PrimeScriptTMRT reagent Kit 和 SYBR Green 試劑（TaKaRa）；其他均為國產分析純。

3 方法

3.1 細菌培養 GBS 由重慶市九龍坡醫院檢驗科細菌培養室提供。將細菌接種到血瓊脂糖培養基中培養16～24 h（37℃，5% CO2），生長至對數生長中期，用生理鹽水清洗2 次，紫外分光光度儀檢測菌液的濁度，稀釋菌液至1×108CFU/L。

3.2 BM 模型的制備 用1%的戊巴比妥鈉（10 mL/kg）對大鼠進行腹腔注射，將動物俯臥位固定于腦立體定位儀，采用微量注射器從小腦延髓池穿刺進針，回抽50 μL腦脊液舍去，模型組注入B族溶血性鏈球菌懸液50 μL，假手術組采用同樣方法注入等量生理鹽水［1］。

3.3 白藜蘆醇給藥 用1%的戊巴比妥鈉（10 mL/kg）對大鼠進行腹腔注射，在接種B 族溶血性鏈球菌后1 h，采用移液槍將白藜蘆醇（DMSO 溶液稀釋，每只5 μL）緩慢滴加入雙側鼻腔中，5 min 之內滴注完畢［14］。

3.4 側腦室注射 用1%的戊巴比妥鈉（10 mL/kg）對大鼠進行深度麻醉，將其俯臥位固定于腦立體定位儀；備皮，消毒后沿顱腦中線作一個縱向切口，在前囟前方1.0 mm，右側1.5 mm 處鉆一個深度2.5 mm 的孔；在大鼠BM 模型建立前48 h，利用微量注射器將 miR-223-3p antagomir（1 nmol/L，無菌生理鹽水稀釋，每只5 μL）或antagomir 陰性對照（1 nmol/L，無菌生理鹽水稀釋，每只5 μL）緩慢注入同側側腦室中。5 min 之內注射完畢后，將針停留10 min 以防止泄露，而后將針緩慢取出。骨蠟封閉鉆孔，縫合切口。

3.5 Loeffler 神經行為學評分 參照Loeffler 神經行為學評分方法［18］，在細菌接種48 h 后進行神經功能評分。具體評分標準為:抓住背部時正常活動，在5 s 內翻身成功為5 分；自主活動減少，在5 s 能翻身為4 分；翻身可以成功，但時間超過5 s 為3 分；不能翻身為2分；不能運動為1分；死亡為0分。

3.6 腦組織處理及HE 染色 在術后48 h，每組隨機取6 只大鼠，用1%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，經左心室快速灌注生理鹽水后斷頭取腦，置于4%多聚甲醛溶液中固定24～48 h，梯度（10%、20%、30%）蔗糖脫水至沉底，OCT包埋，在冰凍切片機中行連續冠狀切片（10 μm），-20℃保存待用。取各組切片進行HE常規染色。

3.7 免疫熒光檢測 切片37 ℃復溫1 h，用0.01 mol/L PBST 洗3 次，4%馬血清37 ℃封閉1 h，滴加 I抗［NeuN（1∶200）、IL-1β（1∶200）、IL-18（1∶100）、GFAP（1∶200）和 Iba1（1∶100）］4 ℃孵育過夜。37 ℃復溫1 h，PBST 洗 3 次，加入相應的熒光II 抗37 ℃避光孵育 1 h，PBST 洗 3 次，DAPI 孵育 5 min，PBST 洗 3次，抗熒光淬滅封片劑封片，熒光顯微鏡下觀察拍照，并用Image Pro Plus 6.0 圖像分析軟件進行分析。若檢測神經元凋亡則需在封片前進行TUNEL染色。

3.8 TUNEL 染色 將切片用 PBS 清洗 2 次，0.5%Triton X-100室溫孵育5 min，加入50 μL TUNEL檢測液（TdT 酶∶熒光標記液=1∶9）于37℃避光孵育60 min，PBS 洗3 次，用抗熒光淬滅封片劑封片后于熒光顯微鏡下觀察，用ImageJ 圖像分析軟件進行定量統計分析。

3.9 Western blot 檢測NLRP3、cleaved caspase-1、IL-1β 和IL-18 蛋白的水平 在術后48 h，每組隨機取6只大鼠通過腹腔注射1%戊巴比妥鈉后，左心室灌注生理鹽水，迅速斷頭取腦，分離保留腦皮質，-80 ℃保存待用。用蛋白裂解液和蛋白酶抑制劑混合液于冰上充分勻漿，14 000 r/min 離心20 min 后收集上清液，使用BCA 法測定蛋白濃度。采用SDS-PAGE 分離蛋白，恒流電轉至聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜，加入抗β-actin（1∶5 000）、NLRP3（1∶1 000）、caspase-1（1∶1 000）、IL-1β（1∶1 000）和IL-18（1∶1 000）等 I 抗 4℃孵育過夜。PBST 洗 3 次，加入相應II 抗（1∶10 000）于37℃孵育1 h，ECL 發光液進行顯色，凝膠成像系統采集圖像，使用Quantity One軟件測量各條帶灰度值，并將目標條帶與內參照條帶灰度值的比值做統計分析。

3.10 RT-qPCR檢測腦組織中miR-223-3p的表達取凍存于-80℃的各組腦組織，根據Trizol 法，加入RNAiso Plus 后冰上充分勻漿，14 000 r/min 離心5 min收集上清液，依次加入氯仿和異丙醇后分別離心10 min，加入75%乙醇后保留沉淀干燥處理，溶于DEPC水中。根據PrimeScriptTMRT reagent Kit逆轉錄合成cDNA。取1 μL cDNA 進行RT-qPCR，按照說明書加入引物，序列見表1。反應條件為:95℃30 s；95℃10 s，60℃30 s，40個循環。檢測每個反應管內的循環閾值（cycle threshold，Ct），利用標準曲線進行定量測定。

表1 RT-qPCR引物序列Table 1.The sequences of the primers for RT-qPCR

3.11 生物信息學查詢 利用在線miRNA 預測軟件 TargetScan（http://www.targetscan.org）查詢 miR-223-3p與NLRP3 mRNA中互補的核苷酸序列。

4 統計學處理

采用SPSS 23.0 軟件對所有數據進行統計學分析。數據結果以均數±標準差（mean±SD）表示。組間均數比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用Bonferroni校正的t檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 大鼠腦組織的病理改變

假手術組大鼠腦膜結構正常，腦內細胞排列規則，無血管充血及炎癥細胞浸潤；腦膜炎模型組大鼠腦膜增厚，腦內細胞排列紊亂，蛛網膜下腔擴張，充血明顯并伴有少量炎癥細胞浸潤，見圖1。

2 不同劑量白藜蘆醇干預對大鼠皮質TUNEL陽性神經元數量的影響

與假手術對照組比較，腦膜炎模型組大鼠腦皮質內TUNEL 陽性神經元數量明顯增加（P＜0.05）；與模型組相比，不同劑量白藜蘆醇干預均可使大鼠腦皮質內TUNEL 陽性神經元明顯減少（P＜0.05）；與0.03 mg/kg 和0.12 mg/kg 白藜蘆醇治療組相比，0.06 mg/kg 白藜蘆醇治療組大鼠腦皮質內TUNEL 陽性神經元減少最為明顯，因此我們選擇0.06 mg/kg白藜蘆醇治療組作為最佳劑量組行進一步的實驗，見圖2。

Figure 1.Representative images of HE staining in sham group and BM group.The black arrows indicate the meninges.圖1 各組大鼠腦組織HE染色

3 白藜蘆醇改善神經功能

與假手術對照組比較，腦膜炎模型組大鼠的Loeffler 神經功能評分顯著降低（P＜0.05）；與腦膜炎模型組比較，白藜蘆醇治療組的Loeffler 神經功能評分明顯增加（P＜0.05），見圖3。

4 白藜蘆醇下調腦膜炎皮質組織中NLRP3、CC-1、IL-1β和IL-18的表達

免疫熒光結果顯示，在腦膜炎模型組中，大鼠腦皮質中IL-1β 和IL-18 分別與神經元標志物NeuN 共表達，見圖4A、B。與假手術對照組比較，腦膜炎模型組大鼠腦皮質內IL-1β 和IL-18熒光強度顯著增強（P＜0.05）；與腦膜炎模型組相比，白藜蘆醇治療組大鼠腦皮質內IL-1β 和IL-18 熒光強度顯著減弱（P＜0.05），見圖4C、D。

Western blot結果顯示，與假手術對照組相比，腦膜炎模型組腦皮質內NLRP3、CC-1、IL-1β 和IL-18 蛋白的相對表達量明顯增高（P＜0.05）；與腦膜炎模型組相比，白藜蘆醇治療組 NLRP3、CC-1、IL-1β 和IL-18蛋白的相對表達量明顯減少（P＜0.05），見圖4E。

5 白藜蘆醇減輕腦膜炎模型腦內星形膠質細胞和小膠質細胞的炎癥反應

假手術對照組表達GFAP 的星形膠質細胞數量較少，分布稀疏，胞體小，突起細而少，表達Iba1的小膠質細胞胞體較小，突起多而細，且表達較少，提示星形膠質細胞和小膠質細胞未被激活。與假手術對照組比較，腦膜炎模型組大鼠腦皮質內表達GFAP的星形膠質細胞明顯增加，胞體顯著增大，突起增長、增粗和增多，表達Iba1的小膠質細胞胞體變大，突起回縮變粗，且表達增多，提示星形膠質細胞和小膠質細胞被激活；與腦膜炎模型組相比，白藜蘆醇治療組大鼠腦皮質內表達GFAP 的星形膠質細胞數量明顯減少，胞體減小，突起減少變細，表達Iba1 的小膠質細胞胞體減小，突起增多、變細，且表達減少，提示星形膠質細胞和小膠質細胞炎癥反應被抑制，見圖5A、B。

Figure 2.The results of TUNEL staining and NeuN immunofluorescence staining in the brain tissues of the rats in each group.A:the representative images of TUNEL staining and NeuN immunofluorescence staining（the images in the white boxs were the magnifications of the areas indicated by the arrows）；B:the statistical analysis of TUNEL positive neurons in each group.Mean±SD. n=6.*P＜0.05 vs sham group；#P＜0.05 vs BM group；&P＜0.05 vs BM+Res（0.06 mg/kg）group.圖2 各組大鼠腦內TUNEL染色及NeuN免疫熒光染色情況的比較

Figure 3.The Loeffler neurological score in each group of the rats.Mean±SD.n=12.*P＜0.05 vs sham group；#P＜0.05 vs BM group.圖3 各組大鼠Loeffler神經功能評分的比較

6 白藜蘆醇上調腦膜炎模型大鼠皮質組織中miR-223-3p的表達

與假手術對照組相比，腦膜炎模型組大鼠腦皮質內miR-223-3p 的相對表達量明顯增高（P＜0.05）；與腦膜炎模型組相比，白藜蘆醇治療組大鼠腦皮質內miR-223-3p 相對表達量明顯進一步增高（P＜0.05），見圖5C。

7 抑制miR-223-3p 減少白藜蘆醇治療的腦膜炎大鼠皮質組織中NLRP3蛋白的表達

利用在線microRNA（miRNA）預測軟件TargetScan 查詢發現miR-223-3p 的部分核苷酸序列與NLRP3 mRNA 3’-URT 的核苷酸序列互補，見圖6A。通過側腦室注射miR-223-3p antagomir，再用Western blot 檢測NLRP3 的蛋白表達變化，結果顯示，與antagomir 對 照 組相比，miR-223-3p antagomir 處 理 組NLRP3 蛋白的相對表達量明顯增加（P＜0.05），見圖6B。

討 論

炎癥反應是組織受到病原體感染、缺血缺氧和外傷等刺激后發生的病理生理反應。一般情況下，炎癥反應是機體免疫系統對外界刺激和損傷的正常應答，發揮清除有害物質和促進組織修復再生的功能；但過度的炎癥反應則對機體細胞造成嚴重損傷［19］。Li 等［20］的研究結果顯示，在鮑氏不動桿菌感染引起的細菌性腦膜炎的發生過程中，炎癥小體（inflammasome）活化誘導的神經細胞焦亡即是神經細胞損傷的形式之一。炎癥小體是一種細胞內調控活性炎癥因子產生的多蛋白復合體，主要由受體蛋白、銜接蛋白和胱天蛋白酶1前體（pro-caspase-1）三部分共同組成［21］。核苷酸結合寡聚化結構域（nucleotidebinding oligomerization domain，NOD）樣受體（NOD-like receptors，NLRs）蛋白家族是受體蛋白中的一類，包括 NLRP1、NLRP2、NLRP3、NLRP6、NLRP7、NLRP12、NLRC4 和 NLRC5 等［22］，其中 NLRP3 炎癥小體被研究得最為深入、廣泛，它通過NLRP3識別感染和氧化應激等刺激，招募和激活蛋白水解酶caspase-1，進而剪切 IL-1β 和 IL-18 的前體（pro-IL-1β 和 pro-IL-18），產生相應的炎癥因子，啟動細胞的炎性死亡，即為焦亡［23-24］。本研究的 Western blot 結果顯示，在GBS 感染引起的大鼠腦膜炎模型中，NLRP3、cleaved caspase-1、IL-1β 和 IL-18 的表達均較假手術對照組增高；免疫熒光結果顯示，IL-1β 和IL-18 在BM 模型組神經元中的熒光強度增加，星形膠質細胞和小膠質細胞被激活。這些結果表明大鼠腦膜炎模型中存在由NLRP3炎癥小體介導的神經細胞炎性死亡（即焦亡）發生，與前人的結果一致。

近年來發現白藜蘆醇有抗炎作用，大量文獻表明白藜蘆醇可通過 PI3K/Akt［7］、Src 激酶［25］和 TRAF6/NF-κB［26］等多種信號途徑在骨關節炎［7］、肺損傷［26］和脊髓損傷［26］等疾病中發揮對抗過敏反應和過度炎癥反應的作用。關于白藜蘆醇用于腦膜炎治療的研究主要集中于它對海馬區的抗炎和神經元保護作用［13-14］。本研究中我們發現白藜蘆醇治療后，動物的神經行為學評分明顯提升，腦皮質區炎癥因子IL-1β和IL-18 的釋放和細胞凋亡數目明顯減少，星形膠質細胞和小膠質細胞炎癥反應被抑制，表明在腦膜炎的抗感染治療中，白藜蘆醇可作為一個潛在有效的輔助治療藥物。另外，我們還發現白藜蘆醇可同時下調腦膜炎模型中腦皮質區NLRP3 和CC-1 的蛋白水平，表明白藜蘆醇可通過調節NLRP3 炎癥小體的活性在腦皮質區發揮抗神經細胞焦亡的作用。

在腦缺血和帕金森病等多種神經系統疾病中，白藜蘆醇可通過調控miRNAs 的表達發揮神經保護作用［17，28］。miR-223 是一種存在于斑馬魚、小鼠、家禽、人類等多種物種中的高度保守的miRNA。在哺乳動物中，miR-223 廣泛表達于血液、肝臟、心臟、肺、腦等各種組織中，參與調節體內脂質代謝、血細胞增殖、抑制成骨細胞分化等作用［28-29］。白藜蘆醇對miR-223的調控作用尚未見報道。在本實驗中，我們在幼年大鼠腦膜炎模型發現腦皮質中miRNA-223-3p水平較對照組顯著升高，白藜蘆醇治療后miRNA-223-3p 進一步升高，可見白藜蘆醇在細菌性腦膜炎模型中可發揮調節miRNA-223-3p 表達水平的作用。另外，我們運用在線軟件TargetScan 查詢發現mi-RNA-223-3p 與NLRP3 mRNA 3'端部分核苷酸序列互補結合；實驗進一步證實，在白藜蘆醇治療的細菌性腦膜炎動物模型中，抑制miR-223-3p 可使NLRP3蛋白的相對表達量明顯增加。由此我們認為白藜蘆醇可通過上調miRNA-223-3p 的表達發揮抑制NLRP3 炎癥小體的功能，進一步抑制下游的caspase-1激活和炎癥因子IL-1β 和IL-18 剪切活化，從而達到抑制神經元焦亡和凋亡的作用。

Figure 4.The expression levels of NLRP3，CC-1，IL-1β and IL-18 in rat brain tissues of each group.A，B:both IL-1β and IL-18 were co-expressed with NeuN in the brain of BM group，respectively（the images in the white boxs were the magnifications of the areas indicated by the arrows）；C，D:the expression of IL-1β and IL-18 detected by immunofluorescence staining in the brain of each group；E:Western blot for determining the protein levels of NLRP3，CC-1，IL-1β and IL-18 in the brain of each group.Mean±SD.n=6.*P＜0.05 vs sham group；#P＜0.05 vs BM group.圖4 各組大鼠腦內NLRP3、CC-1、IL-1β和IL-18表達水平的比較

總之，本研究發現在GBS 感染引起的細菌性腦膜炎模型中神經元發生焦亡和凋亡；白藜蘆醇可能通過調控miRNA-223/NLRP3 通路減輕神經元焦亡和凋亡的發生，從而發揮神經保護作用。

Figure 5.The expression of GFAP and Iba1 was detected by immunofluorescence staining and the expression level of miR-223-3p was detected by RT-qPCR in the rat brain tissues of each group.A，B:the representative images of GFAP and Iba1 expression detected by immunofluorescence staining（scale bar=50 μm）；C:the expression of miR-223-3p.Mean±SD.n=6.*P＜0.05 vs sham group；#P＜0.05 vs BM group.圖5 各組大鼠腦內GFAP和Iba1免疫熒光染色情況及miR-223-3p表達水平的比較