circRNA在心肌纖維化中的研究進展

孫帥鋒　劉巍

通信作者簡介：劉巍，哈爾濱醫科大學附屬第四醫院心血管內科主任醫師、碩士研究生導師、教授、九三學社成員。醫學博士，生物學和病理學博士后。曾赴美國Vermont大學留學。自1998年起，從事心血管內科至今，擅長高血壓病、冠狀動脈粥樣硬化性心臟病、心肌炎、心肌病及心力衰竭、心律失常等的診斷和治療。國家自然科學基金委員會評議專家。2012年起擔任中國醫師協會高血壓專業委員會委員，2013年擔任高血壓青年委員會常委，2016年擔任中華醫學會心力衰竭專業委員會青年委員會委員。獲得發明專利1項。2006年獲得教育部科技進步二等獎，2007年獲得中華醫學三等獎，2003年、2009年及2015年分別獲得黑龍江省政府科技進步二等獎3次。發表SCI論文十余篇，目前主持國家自然科學基金課題2項，黑龍江省留學歸國基金1項，黑龍江省教育廳海外學人重點項目1項，中國博士后特別資助項目1項，省級課題多項。

【摘要】 環狀RNA（circRNA）是一類不能正常編碼蛋白質的共價閉合環狀RNA分子。circRNA涉及許多正常的生理過程和疾病的發病機制。越來越多的研究表明心肌纖維化的發生和發展與circRNA的調節密切相關。該文總結當前關于circRNA生物起源和功能的認識，進一步強調circRNA在心肌纖維化中的最新進展和作為新型生物標志物、治療靶標的潛力。

【關鍵詞】 環狀RNA;心肌纖維化;生物標志物;治療靶標

【Abstract】 Circular RNA （circRNA） are a category of covalently closed circRNA molecules that normally do not encode proteins. circRNA are involved in many physiological processes as well as the pathogenesis of diseases. A growing number of studies have reported that the incidence and development of cardiac fibrosis is closely associated with the regulation of circRNA. This review summarizes the current understanding of circRNA biogenesis and function， highlighting the recent updates regarding the involvement of circRNA in cardiac fibrosis， and their potential as novel biomarkers and therapeutic targets.

【Key words】 Circular RNA;Cardiac fibrosis;Biomarker;Therapeutic target

心血管疾病仍然是全球主要的公眾健康問題，并且是全世界高發病率、高病死率的首要病因之一[1]。心肌損傷后，心肌纖維化是一個持續進展且不可逆的病理過程，其顯著特征是細胞外基質蛋白在心肌間質中積聚[2]。心肌纖維化導致心肌損傷和進行性心臟功能障礙，進而影響心血管疾病患者的臨床預后[3]。心肌纖維化的機制是復雜的，目前仍未完全了解，因此迫切需要提升應對心肌纖維化導致心肌功能損傷的策略，從而進一步降低心血管疾病患者的發病率和病死率。

非編碼RNA（ncRNA）是一大類不能編碼蛋白質的RNA分子，在基本生理過程以及作為許多疾病檢測手段和臨床治療途徑方面發揮著重要作用[4]。基于核苷酸的長度，ncRNA分為兩類：微小RNA（miR）包含19 ～ 24個核苷酸和長鏈非編碼RNA（lncRNA）至少包含200個核苷酸[5]。除了線性ncRNA之外，據報道環狀RNA（circRNA）作為一類新型的ncRNA，在許多疾病的病理生理過程中或許可能成為一種新型且重要的調節劑[6]。已知circRNA可通過miRNA海綿，與RNA結合蛋白（RNP）相互作用調節信使RNA（mRNA）的剪接和穩定性來調節靶基因的表達[7]。本文我們將總結circRNA的生物起源及生物學功能，以及circRNA在心血管疾病（尤其是在心肌纖維化中）的作用。

一、circRNA的生物起源及功能

1. circRNA的生物起源

circRNA早在二十世紀九十年代已有首次記載，據報道目前為止高通量測序已發現超過32 000種 circRNA[8]。circRNA被認為是標準線性mRNA剪接的次級產物，根據其生物合成方式，它們通常分為3種類型：衍生自外顯子的circRNA、衍生自內含子的circRNA和衍生自保留內含子的外顯子的circRNA[9]。“反向剪接”是介導circRNA形成的獨特剪接機制[10]。這種獨特的RNA種類是mRNA前體（前mRNA）剪接產生的，主要是通過一個或兩個外顯子的反向剪接形成[11]。越來越多的研究提出了兩種模型來說明circRNA生物起源中反向剪接環化的機制：外顯子跳躍模型和直接反向剪接模型，但以上兩種模型仍在進一步研究中[12]。

2. circRNA的生物功能

與miR和lncRNA相比，circRNA已經被證明具有miR的海綿，與RNP結合，組裝支架形成，剪接、增強轉錄以及翻譯成蛋白質或多肽的功能[13]。circRNA作為miR“海綿”使得miR不能與其靶基因結合，因此在轉錄控制中起重要作用[14]。circRNA不僅能與miR結合，而且還能與蛋白質結合，這將導致蛋白質功能受到抑制[15]。此外，據報道，細胞核circRNA通過與宿主基因啟動子區域中的RNA Pol Ⅱ反應來調節順式基因的轉錄[16]。盡管circRNA不包含5-末端，通常也不編碼蛋白質，但是一些circRNA可以通過卷環擴增機制編碼蛋白質。據報道，人類circ-ZNF609和果蠅circMbl以僅依賴剪接且不依賴5-末端的方式翻譯成蛋白質[17]。

二、circRNA與心肌纖維化關系

越來越多的研究表明circRNA在諸如心血管疾病、癌癥和神經系統發育過程中發揮著重要作用[18]。心肌纖維化是大多數心血管疾病共同的病理生理過程，例如心肌梗死、心房顫動、心力衰竭和糖尿病。最近，已經確定了ncRNA（miR和lncRNA以及circRNA）之間的交叉調控網絡，從而在許多過程中將ncRNA引入了更多潛在全面的生物學功能[19]。circRNA由于對RNA核酸外切酶（RNase R）的抵抗性而具有高水平的器官特異性表達[20]。有研究表明，circRNA通過miR海綿可能在心肌纖維化過程中發揮著重要的調節作用[21]。

三、circRNA在心肌纖維化中的作用

1. circRNA作為新型生物標志物的潛力

盡管所有類型的ncRNA都可能作為疾病診斷的生物標志物，但是circRNA的某些重要特征使其更具獨特性和優勢。首先，circRNA圓形3和5末端保護它們免受RNase R的降解，從而

使circRNA在細胞外液中更加穩定，并提供了易于檢測的合適條件[22]。其次，circRNA存在于全血中，在血漿、血清、血小板、外周血單個核細胞和細胞外囊泡（如外泌體）中具有較長的半衰期[23]。再次，對心肌組織的深度測序分析明確了人和小鼠器官中circRNA的進化、保守和發育階段特異性以及組織細胞特異性表達[24]。因此，這些特征較好地展示circRNA成為新型生物標志物的獨特自身優勢，為許多疾病提出了新穎的診斷和預測手段。

2. circRNA作為心肌纖維化治療靶標的潛力

2.1 circRNA_000203

circRNA_000203在糖尿病心肌中和用血管緊張素Ⅱ誘導的心肌成纖維細胞（CF）中表達顯著增加。circRNA_000203的過度表達尤其增加CF中膠原蛋白1A2、膠原蛋白3A1和α-平滑肌肌動蛋白的表達。此外，雙熒光基因檢測表明，circRNA_000203可以通過減弱miR-26b-5p與結締組織生長因子和膠原蛋白1A2的相互作用來抑制miR-26b-5p的抗纖維化作用[25]。

2.2 circRNA_010567

circRNA_010567在糖尿病小鼠心肌組織中和

血管緊張素Ⅱ誘導的CF中表達明顯增高。基于生物信息學分析和雙熒光測定，報告顯示circRNA_

010567可以作為miR-141海綿，從而調節轉化生長因子-β1（TGF-β1）的表達。circRNA_010567表達沉默后，miR-141上調和TGF-β1下調，并抑制CF中纖維化相關蛋白的表達，例如膠原蛋白Ⅰ、膠原蛋白Ⅲ和α-平滑肌肌動蛋白等蛋白表達。一般認為，circRNA_010567的過度表達通過靶向miR-141/TGF-β1軸增加了與纖維化相關蛋白的表達[26]。

2.3 circNCX1

circNCX1是NCX1基因的環狀轉錄物，通過海綿miR-133a-3p調節心肌纖維化。在小鼠中使用短發夾RNA抑制circNCX1的表達，顯示小鼠心肌缺血再灌注區域膠原蛋白顯著減少，并且心臟功能有所改善[27]。

2.4 circHIPK3

最新的一項研究表明，從HIPK3基因衍生的circRNA命名為circHIPK3，經血管緊張素Ⅱ處理后，該circRNA在心肌組織和CF中表達顯著升高。在血管緊張素Ⅱ模型中，circHIPK3表達沉默可降低心肌纖維化區域的大小并改善舒張壓。此外，circHIPK3表達沉默后觀察到CF增殖和遷移受到抑制。雙熒光素酶基因測定表明，circHIPK3通過海綿化miR-29b-3p發揮其調節功能，以調節心肌纖維化并降低其靶基因（膠原蛋白1A1、膠原蛋白3A1和α-平滑肌肌動蛋白）的表達[28]。

2.5 circNFIB

最近，Zhu等[29]研究報道circNFIB通過海綿化miR-433發揮至關重要的抗心肌纖維化作用。結果表明，circNFIB過度表達可以抑制CF的增殖。相反，敲除circNFIB基因可以促進CF的增殖。研究表明，circNFIB-miR-433軸可能作為治療心肌纖維化的潛在干預途徑。

2.6 circFndc3b

此外，據報道circRNA通過與蛋白質結合來調節某些蛋白質的功能。例如，一項研究報告表明circFndc3b可以調節融合蛋白的功能進而調節血管內皮生長因子信號傳導。數據表明小鼠心肌梗死后8周，circFndc3b過表達通過增強新生血管形成和減少梗死區域的纖維化而表現出心臟保護作用。在功能上，circFndc3b與融合的RNA結合蛋白相互作用，進而調節血管內皮生長因子的表達和信號傳導，提示circFndc3b可作為改善心肌梗死后心功能和心肌重塑的潛在策略。

四、總結與展望

由于心肌纖維化的生物學基礎和纖維化病理機制仍不十分清楚，因此目前尚無有效的治療方法可用于抑制心肌纖維化的進展。越來越多的證據表明，ncRNA是纖維化過程中（例如細胞因子分泌和細胞外基質合成）的關鍵組成部分。特定的ncRNA在心血管疾病（尤其是心肌纖維化）中作為新型的生物標志物和治療靶標。在ncRNA中，人們對circRNA知之甚少，其在多種生理和病理過程中的功能仍未完全了解。circRNA的生物學特性（包括體液的保守性、穩定性和高豐度） 使其比其他ncRNA更有效地診斷和治療疾病。如上所述，盡管基于circRNA的治療技術手段將面臨許多挑戰，但circRNA仍被視為抗心肌纖維化的重要參與者，并且有望成為心肌纖維化重要的調節劑。

circRNA曾經一度被認為是異常剪接的副產物，隨著高通量測序技術的進步其廣泛的生物學功能被發掘，逐漸成為研究課題的主要熱點。從基因表達調控到翻譯以及和mRNA競爭，circRNA都發揮著至關重要的作用，有可能成為疾病治療的靶標和生物學標志物。但是，關于circRNA基因表達模式和其在生理、病理狀況下的作用機制以及其作為診斷性生物標志物的潛力和作為治療靶標的潛在用途的認識仍處于早期階段。是否更多的circRNA在心肌組織不同類型細胞中發揮作用仍有待研究。另外，關于circRNA調節心肌纖維化作用的詳細機制尚未完全明確，需要進一步的研究來推導circRNA與蛋白質、ncRNA相互作用介導的確切機制。

參 考 文 獻

[1] de Mestral C， Stringhini S. Socioeconomic status and cardiovas-cular disease： an update. Curr Cardiol Rep，2017，19（11）：115.

[2] Travers JG， Kamal FA， Robbins J， Yutzey KE， Blaxall BC. Cardiac fibrosis： the fibroblast awakens. Circ Res，2016，118（6）：1021-1040.

[3] Briasoulis A， Mallikethi-Reddy S， Palla M， Alesh I， Afonso L. Myocardial fibrosis on cardiac magnetic resonance and cardiac outcomes in hypertrophic cardiomyopathy： a meta-analysis. Heart，2015，101（17）：1406-1411.

[4] Barbagallo D， Vittone G， Romani M， Purrello M. Noncoding RNAs in health and disease. Int J Genomics，2018，2018：9135073.

[5] Beermann J， Piccoli MT， Viereck J， Thum T. Non-coding RNAs in development and disease： background， mechanisms， and therapeutic approaches. Physiol Rev，2016，96（4）：1297-1325.

[6] Fischer JW， Leung AK. CircRNAs： a regulator of cellular stress. crit rev biochem mol biol，2017，52（2）：220-233.

[7] Du WW， Zhang C， Yang W， Yong T， Awan FM， Yang BB. Identifying and characterizing circRNA-Protein interaction. theranostics，2017，7（17）：4183-4191.

[8] Zeng X， Lin W， Guo M， Zou Q. A comprehensive overview and evaluation of circular RNA detection tools. PLoS Comput Biol，2017，13（6）：e1005420.

[9] Li Z， Huang C， Bao C， Chen L， Lin M， Wang X， Zhong G， Yu B， Hu W， Dai L， Zhu P， Chang Z， Wu Q， Zhao Y， Jia Y， Xu P， Liu H， Shan G. Exon-intron circular RNAs regulate transcription in the nucleus. Nat Struct Mol Biol，2015，22（3）：256-264.

[10] Li X， Yang L， Chen LL. The biogenesis， functions， and challen-ges of circular RNAs. Mol Cell，2018，71（3）：428-442.

[11] Enuka Y， Lauriola M， Feldman ME， Sas-Chen A， Ulitsky I， Yarden Y. Circular RNAs are long-lived and display only minimal early alterations in response to a growth factor. Nucleic Acids Res，2016，44（3）：1370-1383.

[12] Jeck WR， Sharpless NE. Detecting and characterizing circular RNAs. Nat Biotechnol，2014，32（5）：453-461.

[13] Zeng Y， Du WW， Wu Y， Yang Z， Awan FM， Li X， Yang W， Zhang C， Yang Q， Yee A， Chen Y， Yang F， Sun H， Huang R， Yee AJ， Li R， Wu Z， Backx PH， Yang BB. A circular RNA binds to and activates AKT phosphorylation and nuclear localization reducing apoptosis and enhancing cardiac repair. Theranostics，2017，7（16）：3842-3855.

[14] Kulcheski FR， Christoff AP， Margis R. Circular RNAs are miRNA sponges and can be used as a new class of biomarker. J Biotechnol，2016，238：42-51.

[15] Ashwal-Fluss R， Meyer M， Pamudurti NR， Ivanov A， Bartok? O， Hanan M， Evantal N， Memczak S， Rajewsky N， Kadener S. CircRNA biogenesis competes with pre-mRNA splicing. Mol Cell，2014，56（1）：55-66.

[16] Chen LL. The biogenesis and emerging roles of circular RNAs. Nat Rev Mol Cell Biol， 2016， 17（4）：205-211.

[17] Yang Y， Fan X， Mao M， Song X， Wu P， Zhang Y， Jin Y， Yang Y， Chen L， Wang Y， Cl Wong C， Xiao X， Wang Z. Extensive translation of circular RNAs driven by N6-methyladenosine. Cell Res，2017，27（5）：626-641.

[18] Altesha MA， Ni T， Khan A， Liu K， Zheng X. Circular RNA in cardiovascular disease. J Cell Physiol，2019，234（5）：5588-5600.

[19] Anastasiadou E， Jacob LS， Slack FJ. Non-coding RNA networks in cancer. Nat Rev Cancer，2018，18（1）：5-18.

[20] Rybak-Wolf A， Stottmeister C， Gla?ar P， Jens M， Pino N， Giusti S， Hanan M， Behm M， Bartok O， Ashwal-Fluss R， Herzog M， Schreyer L， Papavasileiou P， Ivanov A， ?hman M， Refojo D， Kadener S， Rajewsky N. Circular RNAs in the mammalian brain are highly abundant， conserved， and dynamically expressed. Mol Cell，2015，58（5）：870-885.

[21] Fan X， Weng X， Zhao Y， Chen W， Gan T， Xu D. Circular RNAs in cardiovascular disease： an overview. Biomed Res Int，2017，2017：5135781.

[22] Ebbesen KK， Kjems J， Hansen TB. Circular RNAs： identifi-cation， biogenesis and function. Biochim Biophys Acta，2016，1859（1）：163-168.

[23] Vausort M， Salgado-Somoza A， Zhang L， Leszek P， Scholz M， Teren A， Burkhardt R， Thiery J， Wagner DR， Devaux Y. Myocardial infarction-associated circular RNA predicting left ventricular dysfunction. J Am Coll Cardiol，2016，68（11）：1247-1248.

[24] Koh W， Pan W， Gawad C， Fan HC， Kerchner GA， Wyss-Coray T， Blumenfeld YJ， El-Sayed YY， Quake SR. Noninvasive in vivo monitoring of tissue-specific global gene expression in humans [published correction appears in Proc Natl Acad Sci U S A. 2014 Jul 29;111（30）：11223]. Proc Natl Acad Sci U S A，2014，111（20）：7361-7366.

[25] Tang CM， Zhang M， Huang L， Hu Z， Zhu J， Xiao Z， Zhang Z， Lin Q， Zheng X， Yang M， Wu S， Cheng J， Shan Z. CircRNA_000203 enhances the expression of fibrosis-associated genes by derepressing targets of miR-26b-5p， Col1a2 and CTGF， in cardiac fibroblasts. Sci Rep，2017，7：40342.

[26] Zhou B， Yu JW. A novel identified circular RNA， circRNA_ 010567， promotes myocardial fibrosis via suppressing miR-141 by targeting TGF-β1. Biochem Biophys Res Commun，2017，487（4）：769-775.

[27] Li M， Ding W， Tariq MA， Chang W， Zhang X， Xu W， Hou L， Wang Y， Wang J. A circular transcript of ncx1 gene mediates ischemic myocardial injury by targeting miR-133a-3p. Theranostics，2018，8（21）：5855-5869.

[28] Ni H， Li W， Zhuge Y， Xu S， Wang Y， Chen Y， Shen G， Wang F. Inhibition of circHIPK3 prevents angiotensin II-induced cardiac fibrosis by sponging miR-29b-3p. Int J Cardiol，2019，292：188-196.

[29] Zhu Y， Pan W， Yang T， Meng X， Jiang Z， Tao L， Wang L. Upregulation of circular RNA circNFIB attenuates cardiac fibrosis by sponging miR-433. Front Genet，2019，10：564.

（收稿日期：2020-02-18）

（本文編輯：楊江瑜）