2 種木霉菌對寒地水稻立枯病病原菌的拮抗作用研究

戰鑫 臺蓮梅* 劉銅 張有利 鄭雯 靳亞忠

（1黑龍江八一農墾大學，黑龍江 大慶163319；2 海南大學植物保護學院，海口570228；第一作者：1323834999@qq.com；*通訊作者：tailianmei@sina.com；liutongamy@sina.com）

黑龍江省寒地水稻種植面積大約為332.5 萬hm2，占全國水稻種植面積的11.0%，是我國水稻種植面積最大的省[1]。水稻立枯病是水稻育苗階段最常見的一種病害，嚴重發生時會引起秧苗成片爛秧和枯死。有研究報道，水稻立枯病由多種病原菌復合侵染所引起，不同地區的病原菌優勢種有所不同，黑龍江地區主要優勢病原菌為禾谷鐮孢菌Fusarium graminearum、茄腐鐮孢菌Fusarium solani、尖孢鐮孢菌Fusarium oxysporium和立枯絲核菌Rhizoctonia solani[2]。在生產上，目前黑龍江主要采用惡霉靈防治水稻立枯病[3]。有報道申嗪霉素、咪鮮胺、惡霉靈等藥劑混配室內對病菌有一定的抑制作用，但生產中未應用[4-5]。由于長期應用單一的殺菌劑防治立枯病，易使病原菌產生抗藥性，降低防效，并造成環境污染。因此，尋找和研發生防制劑防治水稻立枯病，對水稻綠色優質生產具有重要意義。

木霉菌是廣泛存在于土壤中，具有拮抗植物病原物的重要生防微生物，在植物病害生物防治過程中具有重要的、不可忽視的作用。有研究發現，木霉菌對植物病原菌具有廣譜性的拮抗作用，目前發現至少對18個屬29 種病原真菌有拮抗作用[6]。木霉菌可以防治多種由鐮孢菌、絲核菌引起的病害，如甜瓜根腐病、玉米紋枯病。但是，木霉菌對水稻立枯病拮抗作用的研究報道很少。本文擬通過對峙培養、代謝物質對引起寒地水稻立枯病的4 種病原菌抑制作用及幾丁質酶的活性的檢測，研究2 種木霉菌對引起水稻立枯病的4 種病原菌的拮抗效果，為進一步開發復合木霉菌制劑防治水稻立枯病提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 供試菌株

供試原菌：禾谷鐮孢菌Fusarium graminearum、尖孢鐮孢菌Fusarium oxysporium、茄腐鐮孢菌Fusarium solani以及立枯絲核菌Rhizoctonia solani。

供試木霉菌菌株：哈茨木霉（Trichoderma.harziamun）和短密木霉（Trichoderma.breve）。

1.1.2 供試培養基

PDA 培養基、PD 培養液。

木霉菌幾丁質酶產酶培養基：稱取粉末狀幾丁質0.5 g，FeSO4·7H2O 0.01 g，MgSO4·7H2O 0.06 g，KH2PO40.2 g，NH4NO30.3 g，蒸餾水定容至100 mL。

DNS 溶液：37.4 g 酒石酸鉀鈉溶于少量蒸餾水中，加熱至75℃，依次加入3,5 二硝基水楊酸1.26 g、NaOH 4.2 g、無水硫酸鈉1.0 g，攪拌至溶解。冷卻后用蒸餾水定容至200 mL。

1.2 試驗方法

1.2.1 對峙培養

將哈茨木霉和短密木霉和4 種病原菌從保存試管斜面中轉接于PDA 培養基上，于25℃恒溫培養5 d。用打孔器（φ=5 mm）將木霉菌和病原菌打成菌餅，分別對稱接種到平板PDA 培養基兩側，中間相距6 cm。培養7 d 后測量病原菌菌落指向木霉的半徑，空白對照測量病原菌指向圓心的半徑，計算抑制率，并觀察拮抗效果，每個處理5 次重復。

2.4 兩組患者治療前后PV及IPSS評分比較 常規治療組患者治療前后IPSS評分、PV差異無統計學意義(P>0.05)。非那雄胺組患者治療后IPSS評分較治療前明顯改善，PV明顯縮小，差異有統計學意義(P<0.05)。非那雄胺組患者治療后IPSS評分及PV較常規治療組降低，差異有統計學意義(P<0.05)，見表3。

表1 2 種木霉菌對4 種病原菌生長抑制及拮抗作用

圖1 2 種木霉菌對4 種病原菌生長的拮抗

抑制率=（對照菌落直徑-處理菌落直徑）/對照菌落直徑×100%

拮抗效果分級標準：Ⅰ，木霉菌絲占據平皿100%；Ⅱ，木霉菌絲占據平皿＞2/3；Ⅲ，木霉菌絲占據平皿＞1/3但＜2/3；Ⅳ，木霉菌絲占據平皿＜1/3；Ⅴ，病原菌（指示菌）占據平皿100%。

1.2.2 發酵液對病原菌的抑制作用

將活化的木霉轉接于PD 培養基中，置于搖床中培養，轉速為150 r/min，在25℃下培養7 d 后，收集發酵液，然后用0.22 μm 無菌濾膜過濾，將10 mL 過濾液與加熱的40 mL PDA 培養基混合均勻后倒平板，分別轉接4 種不同的病原菌，對照為10 mL PD 培養基與40 mL PDA 培養基均勻混合倒平板。在28℃下培養3 d 后用十字交叉法測量菌落直徑，計算發酵液對病原菌菌絲生長的抑制作用，試驗重復3 次。

1.2.3 揮發性物質對病原菌的抑制作用

揮發性物質對病原菌的抑制作用采用對扣培養法[8]，木霉菌菌餅（φ=5 mm）接種于PDA 平板中央，28℃恒溫培養2 d，在平板上方鋪蓋1 張直徑為9 cm 的單層無菌玻璃紙，然后對扣1 個大小相等且接有直徑5 mm 的病原菌菌餅的平板，封口膜密封后，28℃恒溫培養。以只接種病原菌的平板對扣處理作為對照，每處理重復3 次，3 d 后計算抑制率。

1.2.4 非揮發物質對病原菌的抑制作用

1.2.5 幾丁質酶活性檢測

首先制備膠態幾丁質，其制備方法參照Berger[9]。幾丁質酶活性測定具體操作方法：將發酵2 d、3 d、4 d、5 d、6 d 的發酵液經三層紗布過濾，然后取5 mL 濾液加入2.0 mL 膠態幾丁質，于37℃保溫3 h，然后取2.0 mL 濾液加入1.5 mL DNS、1.0 mL 緩沖液，沸水浴10 min，冷水冷卻至室溫，540 nm 比色測定OD 值。以100℃滅活10 min 的酶液為空白對照，3 次重復。以1 mL 粗酶液每小時分解膠態幾丁質產生l μmol 還原糖（葡萄糖）的酶量定義為1 個酶單位（U）。

1.3 數據分析

采用WPS 2019 和SPSS 20.0 對相關數據進行統計分析。

2 結果與分析

2.1 對4 種病原菌的抑制和拮抗作用

通過對峙培養發現，哈茨木霉和短密木霉對4 種病原菌的生長抑制作用有明顯差異（表1）。哈茨木霉對尖孢鐮孢菌的抑制率最大，為79.04%；短密木霉對禾谷鐮孢菌的抑制率最大，為88.6%。然而2 種木霉對立枯絲核菌的抑制率均最小，分別45.63%和48.59%。通過拮抗觀察，2 種木霉對尖孢鐮孢菌和茄腐鐮孢菌拮抗效果相似，但是短密木霉對禾谷鐮孢菌和立枯絲核菌比哈茨木霉拮抗效果更強。

表2 2 種木霉菌發酵液對4 種病原菌的抑制作用

表3 2 種木霉揮發性物質對病原菌的抑制作用

表4 木霉非揮發物質對病原菌的抑制作用

表5 2 種木霉菌幾丁質酶活性測定 （U/mL）

2.2 發酵液對病原菌的抑制作用

由表2 可以看出，2 種木霉菌代謝液對4 種病原菌均有抑制作用，但是對不同的病原菌的抑制作用有顯著差異。哈茨木霉發酵液對尖孢鐮孢菌抑制率較高，為58.24%，與其他病原菌的處理差異顯著；對茄腐鐮孢菌和禾谷鐮孢菌的抑制率較低，分別為36.74%和43.30%。短密木霉發酵代謝液對茄腐鐮孢菌和禾谷鐮孢菌的抑制率較高，對尖孢鐮孢菌和立枯絲核菌的抑制率較低。

2.3 揮發性物質對病原菌的抑制作用

采用對扣培養法測定了2 種木霉揮發性物質對病原菌的抑制作用。從表3 可見，哈茨木霉和短密木霉均能產生揮發性物質抑制4 種病原菌的生長，但抑制作用不強，短密木霉對茄腐抑制率最高，但是僅為35.29%，對禾谷鐮孢菌抑制效果最差，僅為6.17%。兩種木霉菌對4 種病原菌的抑制效果有顯著差異。

2.4 非揮發性物質對病原菌的抑制作用

利用圓盤濾膜法測定了哈茨木霉與短密木霉的難揮發物質對4 種病原菌的抑制作用。從表4 可見，2 種木霉菌產生的非揮發性物質對4 種病原菌的抑制作用較強，抑制率均在55.00%以上。其中，對禾谷鐮孢菌的抑制效果最好，抑制率分別為66.78%和70.12%，與其他病原菌處理差異顯著。與揮發性物質相比，難揮發性物質對病原菌有更強的抑制效果。

2.5 幾丁質酶活性檢測

2 種木霉菌株分別在培養第3、4、5、6、7 d 后進行幾丁質酶活性檢測，結果發現，2 種木霉菌均能產生幾丁質酶，隨著培養時間增加酶的活性逐漸升高，第4 d達到最大值，隨后酶的活性逐漸降低。哈茨木霉的幾丁質酶的活性最高為1.46 U/mL、短密木霉的幾丁質酶活性最高為1.00 U/mL。哈茨木霉產生的幾丁質酶活性顯著高于短密木霉產生的酶活性（表5）。

3 結論與討論

水稻立枯病的防治主要采用化學防治方法，其防治效果不明顯，并對環境有較大的污染。運用木霉菌進行綠色防治，發展綠色農業十分有意義。選擇拮抗效果好的木霉菌是研制木霉菌制劑的前提。李和平等[10]只通過對峙試驗的方法來篩選木霉菌，篩選方式過于單一。本研究系統的通過競爭作用、抗生作用、溶菌作用等方法研究，能更好地了解哈茨木霉與短密木霉對黑龍江地區水稻立枯病菌的拮抗作用。

研究結果顯示，2 種木霉菌具有較強的營養和空間競爭能力；2 種木霉的非揮發性物質比揮發性物質具有更強的抑制效果，表明木霉的抑菌物質主要來源于非揮發性物質，這與前人報道相一致[8]。木霉菌可以產生大量化學性質各不相同的抗菌物質, 包括戊酮、辛酮、類菇、多膚和氨基酸衍生物等幾大類，其中僅抗真菌的代謝產物便超過70 種，并且多數木霉產生的抗生物質不止一種[11-14]。如哈茨木霉可產生12 種，康氏木霉菌可產生9 種，綠色木霉可產生10 種，鉤狀木霉可產生7 種，長枝木霉可產生3 種，多孢木霉可產生2 種。可見，不同種木霉菌的抗生能力不同。因此，在使用木霉菌進行生物防治時應多種木霉菌復配以提高防治效果。本研究結果表明，哈茨木霉的幾丁質酶活性高于短密木霉，但是短密木霉卻有更好的營養競爭能力和抗生作用。說明2 種木霉菌對供試的4 種病原菌抑制效果不完全一致，與前人報道相符合[15]。通過室內研究后，下一步將哈茨木霉與短密木霉進行復配應用于田間，驗證2 種木霉菌對水稻立枯病的防效。本研究結果可為下一步研發木霉菌制劑防治寒地水稻立枯病提供依據，但對木霉菌的協同抗性有待深入研究。