52例多發(fā)性骨髓瘤患者細(xì)胞免疫表型分析*

蘇 榮,黎觀霞,呂微風(fēng),楊延斌,唐少俊

(1.廣東省佛山市中醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣東佛山528000；2.廣東醫(yī)科大學(xué)檢驗(yàn)學(xué)院,廣東湛江524000；3.廣東省佛山市中醫(yī)院統(tǒng)計室,廣東佛山 528000；4.廣東省佛山市中醫(yī)院計算機(jī)網(wǎng)絡(luò)中心，廣東佛山 528000)

多發(fā)性骨髓瘤(MM)是一種好發(fā)于中老年人的血液系統(tǒng)疾病，發(fā)病率位于血液系統(tǒng)惡性腫瘤的第二位[1]，是一種起源于B淋巴細(xì)胞分化的漿細(xì)胞的克隆性增殖性疾病，主要是以漿細(xì)胞的惡性增殖和溶骨損壞為臨床特征?；颊叨啾憩F(xiàn)為腎功能受影響，分泌M蛋白，出現(xiàn)貧血、骨骼破壞、骨痛和免疫系統(tǒng)功能異常等[2-3]，存活率低。大部分MM患者經(jīng)治療后病情可緩解，生存期也明顯延長，但仍有部分患者病情會進(jìn)一步發(fā)展，其原因?yàn)閷颊卟∏榘l(fā)展階段評估不準(zhǔn)確，使臨床醫(yī)師難以確定患者在后續(xù)治療過程中的時間點(diǎn)、治療方案和藥物濃度。因MM患者病情還受其分泌的免疫球蛋白和伴隨單株免疫球蛋白輕鏈型的影響，故本研究對MM患者的漿細(xì)胞免疫表型(CD38、CD138、CD19、CD56、CD117、CD200)及其分泌的免疫球蛋白、血清游離輕鏈進(jìn)行分析，以期為MM患者的病情監(jiān)測、療效評估及預(yù)后判斷提供幫助。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集廣東省佛山市中醫(yī)院2017年1月1日至2018年12月31日就診的52例MM患者(均為輕鏈型)，其中男28例、女24例，年齡40～83歲。所有MM患者的診斷均符合《中國血液病診斷指南》中相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)。按照Durie-Salmon臨床分期(DS分期)，52例MM患者中Ⅰ期8例，Ⅱ期18例，Ⅲ期26例。

1.2儀器與試劑 貝克曼庫爾特Navios流式細(xì)胞儀及配套試劑(美國Beckman公司)；紅細(xì)胞裂解液，磷酸鹽緩沖液(PBS)，CD138-PE，CD38-FITC，CD19-PC7，CD56-PEcy5，CD117-PE，CD200-PE單克隆抗體；Hydras瓊脂糖凝膠電泳儀及配套試劑(血清蛋白電泳稀釋液A、B)；瑞氏-姬姆薩染液。

1.3方法

1.3.1標(biāo)本采集 采集52例MM患者3 mL靜脈血和3 mL肝素抗凝骨髓液備用，將患者3 mL靜脈血離心，取上層血清待測。

1.3.2血清免疫固定電泳 取分離好的靜脈血清進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。先對患者血清標(biāo)本進(jìn)行血清蛋白電泳(在5個泳道上加入10 μL稀釋后的血清進(jìn)行電泳)。之后分別在各泳道加入蛋白固定劑和5種類型的抗血清觀察結(jié)果,再進(jìn)行血清免疫固定電泳結(jié)果判讀。

1.3.3流式細(xì)胞儀免疫表型檢查 取CD138-PE、CD38-FITC、CD19-PC7、CD56-PEcy5、CD117-PE、CD200-PE單克隆抗體各20 μL，加入流式細(xì)胞儀專用試管中備用。取2 mL采集好的肝素抗凝骨髓液，用PBS將其調(diào)制為(4～10)×106個/毫升的單細(xì)胞懸液，將100 μL單細(xì)胞懸液與20 μL組合好的抗體混合，室溫避光孵育20 min。加入氯化銨溶血劑待液體透亮，1 500 r/min 離心10 min，棄去上清液，加入0.5 mL PBS重懸后上機(jī)。以CD45/SSC配合CD38+/CD138+聯(lián)合設(shè)門，設(shè)定每管收集50 000個細(xì)胞，分析患者的骨髓細(xì)胞免疫表型。

1.3.4骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢查 取0.2 mL采集好的肝素抗凝骨髓液，涂片后室溫晾干，用瑞氏-姬姆薩染液染色15 min，流水沖洗、晾干后，由有經(jīng)驗(yàn)的專職骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢驗(yàn)工作人員進(jìn)行鏡檢。在染色良好推片的體尾交界處分類計數(shù)200個有核細(xì)胞，觀察骨髓瘤細(xì)胞形態(tài)和比例，以骨髓漿細(xì)胞≥10%并伴形態(tài)異常判定為陽性[4]。

2 結(jié) 果

2.1流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果分析 每例骨髓標(biāo)本經(jīng)CD45/SSC設(shè)門后，將骨髓細(xì)胞劃分為淋巴細(xì)胞群、粒細(xì)胞群、單核細(xì)胞群、幼稚細(xì)胞群和骨髓瘤細(xì)胞群，再經(jīng)CD38+/CD138+設(shè)門準(zhǔn)確圈出骨髓瘤細(xì)胞。在本研究中，全部患者的骨髓瘤細(xì)胞占有核細(xì)胞的0.2%～52.9%，漿細(xì)胞約占有核細(xì)胞總數(shù)的9.7%，漿細(xì)胞免疫表型為CD38++(++代表強(qiáng)陽性)、CD138+、CD19-、CD56+、CD117-、CD200+，CD38和CD138都表現(xiàn)為陽性或強(qiáng)陽性，其余免疫表型的表達(dá)為陰性、部分陽性、陽性。血清免疫固定電泳分析結(jié)果顯示，在IgG、κ泳道發(fā)現(xiàn)異常單克隆條帶，表明單克隆免疫球蛋白類型為IgG-κ型。見圖1～2。

2.2MM患者細(xì)胞免疫表型分析 52例MM患者中，CD38和CD138的陽性率均為100.00%，其他免疫表型陽性率由高到低分別為CD56(80.77%)、CD117(40.38%)、CD200(26.92%)、CD19(9.62%)。

2.3兩種輕鏈型MM患者細(xì)胞免疫表型結(jié)果 患者的血清游離輕鏈檢查結(jié)果為κ鏈型27例,λ鏈型25例。在兩種輕鏈型MM患者細(xì)胞免疫表型結(jié)果中，κ鏈型患者CD56的陽性率比λ鏈型患者低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。其他抗原在兩種輕鏈型患者中表達(dá)差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 兩種輕鏈型MM患者細(xì)胞免疫表型陽性結(jié)果比較(n)

2.4不同類型免疫球蛋白MM患者細(xì)胞免疫表型結(jié)果 在不同類型免疫球蛋白MM患者細(xì)胞免疫表型結(jié)果中，CD56的陽性率在3種免疫球蛋白之間表達(dá)差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，其中IgG型最高(25/26)，其次是IgA型(14/15),IgM型最低(3/11)。其他免疫表型在3種免疫球蛋白之間表達(dá)差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2。52例MM患者中有12例患者存在骨轉(zhuǎn)移瘤病變或病情進(jìn)一步發(fā)展，在其免疫表型分析中發(fā)現(xiàn)有8例患者為CD19-CD56-，這8例CD56-患者中有7例患者為IgM-κ型。

表2 不同類型免疫球蛋白MM患者細(xì)胞免疫表型的比較[n(%)]

注：A為CD45/CD38設(shè)門找漿細(xì)胞；B為CD38++/CD19-找異常漿細(xì)胞；C為CD38++/CD56-找異常漿細(xì)胞；D、E分別為異常漿細(xì)胞表型表達(dá)CD117、CD200。圖1 1例MM患者骨髓流式細(xì)胞術(shù)分析散點(diǎn)圖

2.5骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢查與流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果的相關(guān)性 應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測MM患者骨髓細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)骨髓瘤細(xì)胞比例為0.2%～52.9%，骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢查提示骨髓瘤細(xì)胞比例為2.0%～85.5%，可見骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)計數(shù)檢查結(jié)果高于流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果,但兩種方法之間存在一定的相關(guān)性(R2=0.686 4,P<0.05)。見圖3。

注：SP為標(biāo)準(zhǔn)；G為IgG；A為IgA;M為IgM;κ為κ鏈型；λ為λ鏈型;箭頭所指處為異?？寺l帶。圖2 1例MM患者血清免疫固定電泳結(jié)果

圖3 骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢查與流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果的回歸曲線

3 討 論

目前臨床多采用DS分期對MM患者進(jìn)行分期，根據(jù)β2-微球蛋白含量可分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期。對MM患者進(jìn)行血清免疫固定電泳，可根據(jù)患者所分泌免疫球蛋白的類型，分為IgA、IgG、IgM、IgD、IgE、多克隆和不分泌型；還可根據(jù)伴隨單株免疫球蛋白輕鏈型分為λ鏈型和κ鏈型[5]。流式細(xì)胞術(shù)因具有快速、準(zhǔn)確、客觀地檢測腫瘤漿細(xì)胞和正常漿細(xì)胞的免疫學(xué)特性的優(yōu)點(diǎn)，已成為MM診斷和分型的重要工具[3]，并可根據(jù)免疫表型(CD38、CD138、CD19、CD56、CD117、CD200)監(jiān)測患者病情發(fā)展及評估療效。

CD138是一種屬于硫酸肝素類家族的分子,目前被認(rèn)為是漿細(xì)胞最特異的指標(biāo)[6]，其也是最早用于流式細(xì)胞儀檢測骨髓瘤細(xì)胞的免疫表型[7]。本研究以CD45/SSC配合CD38+/CD138+聯(lián)合設(shè)門，分析骨髓細(xì)胞免疫表型的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，CD38、CD138陽性率均為100%，與文獻(xiàn)[2，8]報道一致。

CD56是一種在腫瘤細(xì)胞之間、腫瘤細(xì)胞與成骨細(xì)胞之間調(diào)節(jié)同型細(xì)胞相互作用的黏附分子，是免疫球蛋白超家族中最先被發(fā)現(xiàn)的黏附分子，現(xiàn)已知CD56具有限制骨髓瘤髓外侵襲的作用，所以其與預(yù)后良好相關(guān)[9]，在正常漿細(xì)胞表面基本不表達(dá)，而在MM細(xì)胞表面高表達(dá)。CD56陰性的MM患者是一群特殊的疾病群體，患者具有更高的髓外病變發(fā)生率，臨床表現(xiàn)為原始漿細(xì)胞增多和腎功能損傷，總生存期明顯縮短，疾病更具侵襲性等。GUPTA等[10]指出，與CD56陽性MM患者相比，CD56陰性患者更易出現(xiàn)尿本周氏蛋白陽性和血小板減少、血漿β2-微球蛋白升高,多伴有腎功能異常、髓外浸潤,易發(fā)生貧血，病情進(jìn)展快。有研究證明，在傳統(tǒng)化療方案治療的MM患者中，CD56陰性患者預(yù)后不良，且髓外的病變發(fā)生率較高[11]。蘇顯都等[6]在對47例MM患者的研究發(fā)現(xiàn)，CD56在不同的免疫球蛋白中的表達(dá)差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。本研究結(jié)果顯示，CD56在不同類型免疫球蛋白之間表達(dá)差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，其中IgG型最高，其次是IgA型,IgM型最低；κ鏈型CD56陽性率低于λ鏈型(P<0.05)。這提示CD56的表達(dá)對不同類型免疫球蛋白的區(qū)分和輕鏈型的MM分型有一定的幫助。根據(jù)CD56陰性的患者髓外病變發(fā)生率較高這一特點(diǎn)，筆者推測κ鏈型比λ鏈型更容易發(fā)生髓外病變，而在克隆性免疫球蛋白分型中，IgM要比其他兩種類型免疫球蛋白更容易發(fā)生髓外病變。這可能也與不同的輕鏈型所分泌的免疫球蛋白不同有關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn)，不同輕鏈型的MM患者存在免疫球蛋白定量水平的差異[12-13]。而免疫表型在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)除了受其分泌的免疫球蛋白影響外，還受患者性別、年齡、臨床分期等諸多因素的影響。因此，有關(guān)CD56的陰性表達(dá)可診斷MM和指導(dǎo)臨床治療這一結(jié)論還需進(jìn)一步較大規(guī)模的研究確定。

在本研究中，應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測MM患者骨髓細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)骨髓瘤細(xì)胞比例為0.2%～52.9%，說明流式細(xì)胞術(shù)能將極微量的骨髓瘤細(xì)胞從復(fù)雜的細(xì)胞群中檢測出來，比細(xì)胞形態(tài)學(xué)計數(shù)更靈敏[14]。而每例患者的細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢查骨髓瘤細(xì)胞結(jié)果都比流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果高，可能與流式細(xì)胞術(shù)設(shè)門方案和捕獲細(xì)胞數(shù)有關(guān)，也可能與漿細(xì)胞在骨髓分布中呈局灶性有關(guān)。同時，流式細(xì)胞術(shù)檢測時可能存在選擇性丟失漿細(xì)胞的問題，故骨髓漿細(xì)胞計數(shù)應(yīng)以細(xì)胞形態(tài)學(xué)計數(shù)結(jié)果為準(zhǔn)。由于每一個相關(guān)的免疫表型在骨髓瘤細(xì)胞上并非全部表達(dá)，可能存在缺失、錯譯、跨系表達(dá)的特點(diǎn)，這就要求在診斷MM時需要聯(lián)合多組抗體檢測來提高診斷的準(zhǔn)確性，但目前國內(nèi)還沒有一個統(tǒng)一的最優(yōu)的抗體組合方案。因此，骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢查依然是診斷MM不可替代的重要手段[15]。

4 結(jié) 論

κ鏈型患者CD56的陽性率比λ鏈型低，CD56的陽性率在IgM型中最低。在篩選細(xì)胞方面，流式細(xì)胞術(shù)比細(xì)胞形態(tài)學(xué)更靈敏，但細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢查的骨髓瘤細(xì)胞結(jié)果比流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果更準(zhǔn)確。