某全自動循環熒光免疫分析儀cTnI項目的性能驗證

梅 竹，孫 思,白欣鷺,胡禮儀

(重慶兩江新區第一人民醫院醫學檢驗科，重慶 401121)

心肌肌鈣蛋白I(cTnI)是調節肌肉收縮的肌鈣蛋白復合物中的組成成分，也是僅存在于心肌上而非骨骼上的肌鈣蛋白[1]。敏感和準確的cTnI檢測對心肌梗死的診斷至關重要[2]。cTnI在心肌梗死發生數小時內即可釋放入血，胸痛發作后3～6 h即可在血清中檢出，于12～16 h達到峰濃度，其峰值可超出參考區間幾十倍，具有高度的心肌特異性和敏感性，是目前最理想的心肌梗死診斷標志物之一。快速、準確地檢測人體內cTnI水平與醫學檢驗實驗室工作息息相關。為確保所給出結果的準確性，醫學檢驗實驗室認可工作近年來備受關注。國際標準化組織頒布的醫學實驗室認可標準《醫學實驗室質量和能力的專用要求》(ISO15189)及美國《臨床實驗室改進法案修正案最終法規》(CLIA′88)明確指出，臨床實驗室在開展某一檢測項目前，實驗室需要對其相關方法學分析性能予以驗證，對廠商提供的評價資料中的主要性能予以確認，以及對于儀器配套系統做基本的性能驗證試驗，即對精密度、正確度、可報告范圍和參考區間等進行驗證[3-5]。為此，本實驗室對常規使用的星童Pylon3D全自動循環增強熒光免疫分析儀cTnI項目的主要質量指標進行性能驗證，現將結果報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2019年8月本院體檢中心的健康體檢者20例，其中男、女各10例，年齡20～65歲，所有標本均無溶血、黃疸及脂血。另選取本院患者的低、高值cTnI血清標本各1份。

1.2儀器與試劑 星童Pylon3D全自動循環增強熒光免疫分析儀及原裝配套試劑、校準品，蘇州星童醫療技術有限公司生產的低值質控品(批號2103171801)及高值質控品(批號2203171801)。

1.3方法

1.3.1精密度驗證 批內精密度(重復性)測定：按照操作說明書的要求對儀器進行常規的保養、維護和校準，保證室內質控在控的前提下再進行驗證試驗。選擇患者低、高值cTnI新鮮血清標本各1份，在較短間隔時間內各標本連續重復測定10次，計算均值、標準差與變異系數(CV)。參照美國臨床實驗室標準化協會(CLSI)EP15-A2評價方案，將所得結果與廠商提供的性能指標和公認的質量目標進行比較，若批內CV≤1/4允許總誤差(TEa)，說明該檢測系統的精密度符合要求。

1.3.2靈敏度驗證 采用廠家配套的稀釋液按一定比例的關系配制成系列水平的標本，按照要求測試10次。判斷現有靈敏度與測量下限范圍是否相符。判斷標準：參照CLSI EP17-A2評價方案，如有不超過1個數值(測試結果的10%)在初始采納的檢測下限(0.025 ng/mL)外，認為實驗室采納的靈敏度可接受。

1.3.3正確度驗證 參照CNAS-CL38:2012《醫學實驗室質量和能力認可準則在臨床化學檢驗領域的應用說明》(簡稱CNAS-CL38：2012)的評價方案，用廠家質控品或標準品作為定值參考物質。最少測定高、低2個水平的質控品或標準品，每個水平重復測定2次，根據兩次測定結果的平均值與靶值來計算偏倚，以偏倚≤20%為可接受。

1.3.4線性范圍驗證 參照CLSI EP6-A2評價方案并結合相關報道[6]，選取1份高值cTnI血清標本(H)，1份低值cTnI血清標本(L)，按照平均斜率法稀釋為梯度水平標本，即將H和L按5L、4L+H、3L+2H、2L+3H、L+4H、5H的比例混合成6份標本。對所有標本進行2次測定，取其均值進行結果計算和判斷(在高水平標本不易獲取時，可以通過在低水平標本中添加分析物制備)。計算結果時，以預測值即理論水平為橫軸，實際測量值的均值為縱軸，繪制散點圖，進行回歸分析，得出線性回歸斜率b、相關系數r，以及直線回歸方程Y=bX+a。若相關系數r≥0.975，b值為0.9～1.1，a接近于0，則線性范圍驗證通過。

1.3.5參考區間驗證 本項目的參考區間引用原國家衛生部頒布的參考區間。按相關要求從健康體檢人群中選取20例，判斷現有參考值范圍與測量范圍是否相符。判斷標準：如有不超2個數值(測試結果的10%)在初始采納的參考范圍外，那么實驗室采納的參考范圍可接受，即該參考區間可有效地應用于本實驗室。

1.3.6方法學比對 參照CLSI EP9-A2評價方案，進行星童Pylon3D免疫熒光法與西門子化學發光法cTnI檢測結果的比對。按照要求選取10份血清標本，在保證檢測系統處于良好狀態下，將兩種儀器所檢測的cTnI結果進行比較。以星童Pylon3D免疫熒光法的檢測結果為Y軸，西門子化學發光法的檢測結果為X軸，繪制散點圖，計算回歸方程。得到直線回歸方程Y=bX+a，若相關系數r≥0.975，則說兩種儀器所用方法檢測的cTnI結果具有較好的相關性。

1.4統計學處理 采用SPSS16.0軟件和Excel2003軟件進行統計處理和分析，采用直線相關與回歸分析數據間的關系，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1精密度驗證結果 星童Pylon3D全自動循環增強熒光免疫分析儀檢測cTnI的批內精密度結果顯示，在批內測定低、高水平標本的均值分別為0.214、60.600 ng/mL，標準差分別為0.013和4.270，CV分別為6.13%、7.05%，CV均小于廠家最大允許誤差(10%)，且均<1/4TEa。

2.2靈敏度驗證結果 采用廠家配套的稀釋液按一定比例的關系配制成系列水平的標本，按照要求使用星童Pylon3D全自動循環增強熒光免疫分析儀測試10次。結果顯示，10份標本的測試結果<0.025 ng/mL，無任何1例數據在初始采納的檢測下限(0.025 ng/mL)外，符合EP17-A2評價方案標準，靈敏度驗證通過。

2.3正確度驗證結果 結果顯示，低水平質控品檢測結果均值為0.212 ng/mL，靶值為0.245 ng/mL，計算其偏倚為13.50%；高水平質控品檢測結果均值為0.841 ng/mL，靶值為0.888 ng/mL，計算其偏倚為5.29%。高、低兩個水平質控品檢測結果的偏倚≤20%，符合CNAS-CL38：2012評價方案標準，正確度驗證通過。

2.4線性范圍驗證結果 對所有標本進行2次測定，取其均值進行結果計算和判斷，得到直線回歸方程Y=1.022 3X+0.065 1(R2=0.998 9)，相關系數r>0.975，b值為0.9～1.1，a接近于0，說明預期值與實測值相關性好，線性范圍驗證通過。見表1。

表1 線性范圍驗證結果(nmol/L)

2.5參考區間驗證結果 按照要求從健康體檢人群中選取20份采集血清標本，經檢測，無檢測值在初始采納的參考范圍(0.1 ng/mL)外，即均處于所引用的參考區間內，說明該生物參考區間適用于本實驗室。見表2。

表2 參考區間驗證結果(ng/mL)

2.6方法學比對結果 選取10份血清標本，在保證檢測系統處于良好狀態下，進行星童Pylon3D免疫熒光法與西門子化學發光法cTnI項目檢測結果的比對。直線回歸方程為Y=2.103 8X+0.005 2(R2=0.999 7)，相關系數r=0.999 8>0.975，可見兩種方法有較好的相關性。見表3。

表3 方法學比對結果(ng/mL)

3 討 論

在臨床工作中，臨床醫生常依靠醫學實驗室給出的結果對患者進行診斷、用藥指導及預后評估等。因此，醫學實驗室需要確保所給出結果的準確性，實驗室檢測系統的良好分析性能是保證檢驗結果準確的前提。根據《醫療機構臨床實驗室管理辦法》的要求和《醫學實驗室認可準則》的規定，臨床實驗室在開展新的檢測項目、更換檢測系統或改變檢測試劑盒時必須對主要分析性能進行驗證或確認，以證實其滿足要求。星童Pylon3D全自動循環增強熒光免疫分析儀在本實驗室用于cTnI項目檢測，盡管廠家聲明本儀器具有良好的性能，但針對本實驗室，該儀器的主要性能如精密度、正確度、線性范圍、生物參考區間等仍需進一步驗證[7-9]。

精密度是反映方法學性能的主要指標，體現了系統的隨機誤差，可確保標本在實驗室檢測過程中的穩定性、可靠性，良好的精密度和準確度是保證結果準確的前提，也是進行其他性能驗證試驗的前提[10]。常規的精密度驗證參考品至少需要包含兩個水平，因此本實驗室在批內測定了兩個不同水平cTnI新鮮血清標本各1份，為盡可能地排除各類影響因素，在較短間隔時間內各標本連續重復測定10次，計算各指標。驗證結果顯示，低、高水平標本的批內CV分別為6.13%、7.05%，參照CLSI EP15-A2評價方案，均遠低于廠家最大允許誤差(10%)，且均小于1/4TEa。以上驗證結果提示，星童Pylon3D全自動循環增強熒光免疫分析儀檢測系統的精密度符合要求，可以投入臨床使用。

靈敏度是指某方法對單位濃度或單位量待測物質變化所致響應量的變化程度，觀察某種方法是否能夠快速檢出待測指標，也是反映方法學性能的重要指標之一[11]。參照EP17-A2評價方案，本實驗室采用廠家配套的稀釋液按一定比例的關系配制成系列水平的標本，按照要求使用星童Pylon3D全自動循環增強熒光免疫分析儀測試10次。結果提示所有數據均在初始采納的檢測下限內，符合EP17-A2評價方案標準，分析靈敏度驗證通過。

正確度可反映檢測系統的系統誤差。驗證有兩種方法：(1)待驗證的方法與其他檢驗方法或試劑盒同時檢測患者標本來進行正確度驗證；(2)用參考物質進行正確度驗證試驗[12]。本實驗室采用第二種方法對cTnI項目加以驗證，測定廠家提供的高、低兩個水平的質控品，每個水平均重復測定2次，根據兩次測定結果的均值與靶值來計算偏倚。驗證結果提示，高、低兩個水平質控品的相對偏倚分別為13.50%和5.29%，均≤20%，符合CNAS-CL38：2012評價方案標準，表明該檢測系統正確度性能符合要求。

在日常檢驗工作中，可能存在少數病例某一指標直接檢測結果為陰性，但增加一定稀釋倍數再測結果即可變為陽性，這就與檢測系統的線性范圍相關。線性范圍定義為患者標本未經任何稀釋、濃縮等預處理，由檢驗方法得到可靠結果的范圍，其反映了分析結果與標本真實水平之間呈恒定比例的關系，所以患者結果可報告范圍可視為對系統線性范圍的驗證。依據EP6-A2文件方案，線性范圍驗證可進行多項式回歸計算，或者國內常用的較簡便的平均斜率法[13]。結合實際情況，本實驗室選擇了平均斜率法，經計算發現預測值與實際測量值之間相關性好(相關系數r>0.975)，提示線性范圍驗證通過，滿足臨床實際應用要求。

通常某一指標的參考區間是研究人員對未患相應疾病的健康人群進行相應檢查，用統計學方法對檢查結果進行統計，取其95.0%或97.5%的范圍作為參考范圍。而不同地區、不同實驗室都會確定實驗室檢測項目的參考范圍，只有這樣才能有效指導臨床正確分析試驗結果。由于參考區間的建立是針對某一部分人群確立的，對于一些生物學變異較大的測試項目，不同人種乃至不同地區的人群，其參考范圍不盡相同。ISO15189要求實驗室在每個新的測試項目開展前或其分析方法學改變，甚至患者群體改變時都需要進行參考區間驗證試驗[14]。美國病理學家學會(CAP)要求對引用的試劑說明書、參考文獻中的參考區間進行證實。實驗室檢測了20份健康體檢人群血清標本，結果顯示所有結果均在初始采納的參考范圍內，該生物參考區間適用于本實驗室。

在日常的臨床工作中，實驗室常常會使用一些新的方法、試劑、儀器，但是在使用它們之前，往往需要對其進行一些評價。有學者認為，其中很重要的一項便是和實驗室目前使用的方法、試劑、儀器進行方法學比對試驗，以確定新方法、試劑、儀器測定的結果是否在允許的范圍內[15]。CLSI頒發的EP9-A2文件可以指導實驗室使用患者標本進行方法學比對。本研究中，實驗室嚴格按照EP9-A2文件，選取10份血清標本，在保證檢測系統處于良好狀態下，進行星童Pylon3D免疫熒光法與西門子化學發光法cTnI項目檢測結果的比對。結果提示，兩種儀器所用方法檢測的cTnI結果具有較好的相關性，說明星童Pylon3D免疫熒光法可以在臨床工作中使用。

綜上所述，星童Pylon3D全自動循環增強熒光免疫分析儀性能好，既能符合質量目標要求，又能滿足臨床對cTnI的定量檢測要求。