食管癌組織中TROP2的表達水平及臨床意義

庹曉霞

(四川省廣元市婦幼保健院檢驗科，四川廣元 628000)

食管癌是發生于食管上皮的消化道惡性腫瘤，具有一定的地域分布差異，我國是食管癌發病率及病死率較高的國家之一，死亡患者占全部惡性腫瘤死亡患者的1/4，嚴重威脅患者生命健康[1]。目前外科手術切除仍為食管癌治療的首選方案，但因早期食管癌無明顯特異性表現，多數患者就診時已屬中晚期，術后預后較差。因此，早期診斷并評估疾病進展趨勢是改善食管癌患者預后的有效途徑。近年來隨著分子生物學技術的發展，相關基因的表達也逐漸被用于惡性腫瘤的診斷及預后評估中，為疾病的防治提供了一定參考。人滋養層細胞表面抗原-2(TROP2)是一種跨膜表面糖蛋白，因在人滋養層細胞表達量較高而得名，其表達量高也被認為是胎盤具有較強侵襲力的重要原因[2-3]。近年的研究證實，TROP2的表達也與人類惡性腫瘤相關，其在多種實體腫瘤中均存在高表達，與腫瘤侵襲、轉移及預后有密切聯系[4-5]。目前TROP2的表達與食管癌的關系研究較缺乏，本研究對食管癌組織中TROP2及基質金屬蛋白酶-9(MMP-9)、上皮性鈣黏附蛋白(E-cadherin)基因mRNA表達情況進行檢測，分析其相關性，并對TROP2蛋白表達情況進行檢測，分析其與臨床指標及預后的關系，旨在為臨床應用提供參考。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2009年7月至2018年9月于本院行外科手術的85例食管癌患者作為研究對象，以手術切除的食管癌組織作為研究標本。食管癌患者納入標準：初治患者；經病理學診斷為食管癌；臨床資料完整。排除標準：行外科手術前進行放療、化療及其他療法者；合并心腦血管疾病者；合并自身免疫性疾病者。85例食管癌患者中男59例，女26例；年齡35～70歲，中位年齡53歲；鱗癌75例，腺癌10例；部位：胸上段3例，胸中段49例，胸下段33例；分化程度：高分化6例，中分化47例，低分化32例；腫瘤浸潤深度：黏膜及黏膜下層6例，肌層30例，外膜49例；病理分期：Ⅰ期19例，Ⅱ期48例，Ⅲ期18例；淋巴結轉移者20例，未轉移者65例。另從這85例食管癌患者中選擇50例距食管病變邊緣5 cm以上的癌旁組織作為對照，所有對照標本組織均經病理科證實無異常改變。

1.2方法

1.2.1標本采集及保存 食管癌組織取手術后病灶中心組織，癌旁組織取距食管病變邊緣5 cm以上的正常組織。所有標本取得后立即置于液氮中保存。

1.2.2RT-PCR檢測mRNA表達 (1)總RNA提取及反轉錄：采用Trizol法進行組織標本RNA提取，采用StarScriptⅡ First-strand cDNA Synthesis Mix試劑盒進行反轉錄，獲取cDNA進行水平檢測。(2)RT-PCR：引物序列，TROP2(正向5′-TAC GAG CAG CCC ACC ATC C-3′，反向5′-TCG GTT CCT TTC TCA ACT CCC-3′)；MMP-9(正向5′-GCG GAT CCA GCG CCC AGA GAC AC-3′，反向5′-TGG ACG ATG CCT GCA ACG TG-3′)；E-cadherin(正向5′-CGA CCC AAC CCA AGA ATC TA-3′，反向5′-AAT GGC AGG AAT TTG CAA TC-3′)；甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH，正向5′-ATC TGG CAC CAC ACC TTC TAC A-3′，反向5′-GAT AGC ACA GCC TGG ATA GCA A-3′)。反應條件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35個循環；72 ℃ 5 min。(3)結果觀察及統計：采用2.0%瓊脂糖凝膠進行電泳，以各基因mRNA表達與GAPDH條帶亮度比值作為表達量。

1.2.3免疫組織化學法檢測TROP2蛋白表達 (1)免疫組織化學染色：組織標本采用多聚甲醛固定，石蠟包埋并切取4 μm的石蠟切片。石蠟切片脫蠟后磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗3次，采用3%過氧化氫溶液室溫孵育10 min，過氧化物酶滅活后PBS沖洗3次。加入5%的牛血清清蛋白，37 ℃孵育10 min。滴加羊抗人TROP2多克隆抗體(1∶100，英國Abcam公司)，4 ℃孵育過夜，PBS沖洗。加入即用型羊抗兔鼠二抗(英國Abcam公司)37 ℃孵育30 min，PBS沖洗。加入S-P溶液，37 ℃孵育30 min，PBS沖洗，采用二氨基聯苯胺顯色，鏡檢顯色滿意后可終止顯色，經復染、脫水、透明、封片等操作完成制片。(2)結果判定：免疫組織化學切片鏡檢，根據染色細胞數占總數的百分比進行染色范圍計分，其中無染色為0分；不足10%為1分；10%～50%為2分；>50%～80%為3分；>80%為4分。根據染色細胞的染色深淺進行染色強度計分，其中無著色為0分；黃色(+)為1分；淺棕色(++)為2分；棕褐色(+++)為3分。根據染色強度及范圍的積分(乘積)評價陽性表達情況：積分0～3分為陰性表達(-)；積分>3～6分為弱陽性表達(+)；積分>6～9分為陽性表達(++)；積分>9～12分為強陽性表達(+++)；以積分≥4分判定為陽性表達。

2 結 果

2.1TROP2、MMP-9、E-cadherin基因mRNA在食管癌組織中的表達情況 RT-PCR結果顯示，癌旁組織中TROP2、MMP-9基因mRNA的相對表達量明顯低于食管癌組織，E-cadherin基因mRNA的相對表達量明顯高于食管癌組織，差異均有統計學意義(P<0.05)。Pearson相關分析提示，TROP2基因mRNA表達量與MMP-9基因mRNA表達量呈正相關(r=0.326，P<0.05)，與E-cadherin基因mRNA表達量呈負相關(r=-0.307，P<0.05)。見圖1。

注：A為電泳結果；B為TROP2、MMP-9、E-cadherin基因mRNA相對表達量檢測結果；與癌旁組織比較，*P<0.05。圖1 TROP2、MMP-9、E-cadherin基因mRNA在食管癌組織中的表達情況

2.2TROP2蛋白在食管癌組織中的表達情況 免疫組織化學結果顯示，TROP2蛋白在食管癌癌旁組織中未見或少量表達，免疫組織化學染色積分0～6分，平均(4.15±1.07)分，陽性表達率為14.00%(7/50)；TROP2蛋白在食管癌中主要表達于腫瘤細胞的細胞膜及細胞質內，細胞核不著色，免疫組織化學染色積分0～12分，平均(6.98±2.71)分，陽性表達率為42.35%(36/85)。食管癌組織TROP2蛋白免疫組織化學染色積分顯著高于癌旁組織，陽性表達率明顯高于癌旁組織(P<0.05)。部分食管癌組織TROP2蛋白表達情況見圖2。

注：A為陰性表達；B為陽性表達。圖2 食管癌組織中TROP2蛋白表達情況(×200)

2.3TROP2蛋白表達與食管癌臨床資料的關系 腫瘤分化程度、浸潤深度、病理分期、淋巴結轉移與食管癌患者TROP2蛋白表達相關(P<0.05)。見表1。

表1 TROP2蛋白表達與食管癌臨床資料的關系[n(%)]

2.4TROP2蛋白表達的影響因素分析 多因素Logistic回歸分析提示，腫瘤浸潤深度、病理分期與TROP2蛋白表達相關(P<0.05)。見表2。

表2 TROP2蛋白表達陽性的影響因素分析

2.5不同TROP2蛋白表達的食管癌患者生存曲線分析 85例患者均進行隨訪，隨訪截止日期為2019年3月，隨訪時間為5～90個月。Log-rank檢驗顯示，TROP2蛋白陽性表達組生存率明顯低于陰性表達組(χ2=8.623，P<0.05)。Kaplan-Meier生存曲線見圖3。

圖3 不同TROP2蛋白表達的食管癌患者Kaplan-Meier生存曲線

2.6影響食管癌預后的COX多因素分析 COX多因素分析提示，食管癌患者腫瘤浸潤深度、分化程度、病理分期及TROP2蛋白表達是預后不良的獨立危險因素(P<0.05)。見表3。

表3 影響食管癌預后的COX多因素分析

3 討 論

TROP2基因所編碼的產物為含323個氨基酸的蛋白質，是一種腫瘤相關抗原，在角膜、胰腺等諸多器官中均有表達，其在多層上皮細胞、滋養層細胞表達量較高[6]。近年來的研究證實，TROP2基因在大腸癌、肺癌、乳腺癌等諸多實體瘤中均存在高表達，且可能與腫瘤的侵襲性相關，可作為部分腫瘤基因治療的靶點[7]。

本研究從轉錄水平分析食管癌患者TROP2基因及其下游MMP-9、E-cadherin基因表達情況，結果顯示食管癌組織中存在TROP2、MMP-9高表達及E-cadherin低表達。既往研究表明，TROP2、MMP-9高表達及E-cadherin低表達是細胞發生上皮細胞-間質轉化(EMT)的重要標志[8]，本研究結果進一步證實TROP2及其下游基因的表達與腫瘤的發生相關。免疫組織化學法均提示食管癌組織存在TROP2蛋白高表達。此外，食管癌患者TROP2蛋白表達與患者腫瘤分化程度、浸潤深度、病理分期、淋巴結轉移相關。多因素Logistic回歸分析提示,腫瘤浸潤深度、病理分期與TROP2蛋白表達相關，提示TROP2蛋白可能參與食管癌的發生及發展過程。既往關于TROP2在食管癌組織的表達相關研究較少，周永清等[9]以胃癌組織作為研究材料，證實胃癌組織中TROP2 蛋白表達與腫瘤浸潤深度、淋巴結轉移及病理分期相關；國外一項研究也證實，TROP2 蛋白在肺腺癌組織中存在高表達(67%)[10]。本研究在前人研究結果基礎上,進一步證實TROP2蛋白參與食管癌的發生及發展。目前TROP2蛋白影響惡性腫瘤生物學行為的相關機制尚未明確，研究認為可能與TROP2 蛋白參與EMT 相關蛋白調節相關。EMT是上皮細胞在病理條件下向間質細胞轉化的現象，這一過程可伴細胞去極性、細胞形態改變、上皮細胞分子標記減少、基質金屬蛋白酶相關成員活性增加等[11-12]。楊勇等[13]開展的一項細胞學研究證實，抑制食管癌TROP2基因表達可降低腫瘤細胞增殖、侵襲的能力，其機制與下調基質金屬蛋白酶-2、磷脂酰肌醇-3激酶相關。

本研究分析了TROP2蛋白與食管癌患者預后的關系，結果顯示，TROP2蛋白陽性表達患者生存率明顯低于陰性表達患者，這一結果與既往其他惡性腫瘤的相關報道一致[14-15]。如前文研究所示，TROP2蛋白表達量與腫瘤侵襲性呈一定程度相關，TROP2蛋白表達陽性患者可能病情進展更為迅速，局部復發風險更高，因此預后相對較差。目前多數研究認為食管癌患者的預后受到腫瘤浸潤深度、淋巴結轉移及病理分期等諸多因素的影響[16-17]，本研究COX多因素分析提示，在校正其他因素后，TROP2蛋白高表達的患者預后不良的風險為低表達患者的1.454倍，提示TROP2蛋白的表達情況與食管癌患者預后相關，可作為早期預后評價的參考指標。但本研究存在一定局限，因樣本量有限，在預后評估方面對術后治療方案未進行分析，可能使結果存在一定誤差，下一步工作仍將擴大樣本量，并將治療相關因素納入研究。

4 結 論

綜上所述，食管癌組織存在TROP2蛋白表達明顯升高，其表達情況與患者腫瘤侵襲性及預后均有一定關系。