手足口病病毒核酸及抗體檢測(cè)的比較研究及應(yīng)用*

趙 云，蔡晶娟△，彭 程，王紫荊，尹清金，孫照華，牟 楊，盧亞陵，蔣 燕，宋曉燕

(1.成都兒童專科醫(yī)院，四川成都 610015；2.四川省廣安市人民醫(yī)院，四川廣安 638001；3.成都市婦女兒童中心醫(yī)院，四川成都 610091)

手足口病是一種由腸道病毒感染所引起的傳染性疾病，其主要的病原體包括腸道病毒71型(EV71)和柯薩奇病毒A16型(CA16)，好發(fā)于5歲以下的兒童[1-2]。重癥病例可并發(fā)中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥、心肌炎、神經(jīng)源性肺水腫等，患兒早期臨床癥狀不典型、病情常急轉(zhuǎn)直下，往往在發(fā)病早期突然出現(xiàn)預(yù)后不良的情況，并由此引發(fā)醫(yī)患矛盾[3-4]。對(duì)手足口病患兒實(shí)施隔離可切斷手足口病的傳染源，是預(yù)防手足口病流行的重要措施，而患兒的排毒時(shí)間是制訂隔離期的重要參考。極少數(shù)重癥患兒皮疹不典型，臨床診斷困難。因此，對(duì)手足口病患兒進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室早期診斷以及對(duì)EV71與CA16等腸道病毒的感染進(jìn)行準(zhǔn)確鑒別就顯得非常重要[5-6]。本研究采用腸道病毒核酸檢測(cè)聯(lián)合血清學(xué)抗體檢測(cè)方法，探討該方法在手足口病診斷及防控中的臨床應(yīng)用價(jià)值，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2017年5月至2019年2月在成都兒童專科醫(yī)院就診的手足口病患兒，臨床診斷均符合2018年國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)制定的《手足口病診療指南(2018年版)》標(biāo)準(zhǔn)，使用RNA恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)技術(shù)(SAT)對(duì)手足口病患兒進(jìn)行EV71及CA16核酸檢測(cè)，同時(shí)采用膠體金法(金標(biāo)法)對(duì)患兒血清中的EV71、CA16特異性IgM抗體進(jìn)行聯(lián)合檢測(cè)。將上述檢測(cè)方法中任意一項(xiàng)出現(xiàn)陽性的患兒納入研究。納入290例手足口病患兒，其中男170例，女120例；年齡4個(gè)月至11歲，中位年齡2.9歲，<1歲患兒28例，1～5歲患兒225例，>5歲的患兒37例。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)家長(zhǎng)不合作或失訪的患兒;(2)初診時(shí)病毒核酸及抗體標(biāo)本檢測(cè)均為陰性的患兒。本研究經(jīng)成都兒童專科醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，入組患兒的監(jiān)護(hù)人均已簽署知情同意書。

1.2儀器與試劑 實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀由西安天隆科技有限公司生產(chǎn)，型號(hào)為TL988；試劑采用北京萬泰生物藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)的CA16和EV71 IgM抗體檢測(cè)試劑盒(膠體金法)。

1.3方法

1.3.1核酸檢測(cè)方法 通過SAT，以病原體特異的16s rRNA為靶標(biāo)，在M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶和T7 RNA多聚酶的作用下進(jìn)行恒溫?cái)U(kuò)增，產(chǎn)生的大量RNA與帶有熒光標(biāo)記的優(yōu)化探針特異性結(jié)合，擴(kuò)增信號(hào)和熒光信號(hào)的檢測(cè)同步進(jìn)行，從而實(shí)現(xiàn)了病原體的快速檢測(cè)。

1.3.2血清學(xué)抗體檢測(cè)方法 將采集的全血標(biāo)本立即進(jìn)行離心，取上清液，血清標(biāo)本嚴(yán)格按照試劑盒說明書上的操作流程進(jìn)行檢測(cè)。

1.4觀察指標(biāo) 比較初診及病程2周的復(fù)診患兒CA16、EV71核酸和CA16、EV71抗體檢測(cè)結(jié)果。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理和分析。計(jì)數(shù)資料以百分率或例數(shù)表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)或Fisher確切概率法，等級(jí)資料比較采用秩和檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1兩種檢測(cè)方法在不同年齡初診患兒中的檢出率比較 初診患兒中EV71核酸檢測(cè)陽性17例(5.9%)，CA16核酸檢測(cè)陽性81例(27.9%)，核酸檢出率為33.8%(98例)；EV71血清學(xué)抗體檢測(cè)陽性153例(52.8%)，CA16血清學(xué)抗體檢測(cè)陽性183例(63.1%)，血清學(xué)抗體檢出率為84.5%(245例，其中雙抗體陽性91例)。兩種檢測(cè)方法檢出率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。兩種方法聯(lián)合檢測(cè)陽性286例(98.6%)。<1歲初診患兒核酸檢測(cè)陽性5例，抗體檢測(cè)陽性24例，兩種檢測(cè)方法檢出率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；1～5歲初診患兒兩種檢測(cè)方法檢出率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；>5歲初診患兒兩種檢測(cè)方法檢出率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 不同年齡初診患兒兩種檢測(cè)方法結(jié)果比較(n)

2.2兩種檢測(cè)方法在不同年齡復(fù)診患兒中的檢出率比較 復(fù)診患兒中核酸檢測(cè)陽性49例(16.9%)，其中EV71核酸檢測(cè)陽性11例(3.8%)，CA16核酸檢測(cè)陽性38例(13.1%)。抗體檢測(cè)陽性240例(82.8%)，其中EV71血清學(xué)抗體檢測(cè)陽性177例(61.0%)，CA16血清學(xué)抗體檢測(cè)陽性207例(71.4%)。兩種檢測(cè)方法檢出率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。<1歲復(fù)診患兒核酸檢測(cè)陽性2例(0.69%)，抗體檢測(cè)陽性23例(7.93%)，兩種檢測(cè)方法檢出率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；1～5歲復(fù)診患兒兩種檢測(cè)方法檢出率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；5歲以上復(fù)診患兒兩種檢測(cè)方法檢出率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 不同年齡復(fù)診患兒兩種檢測(cè)方法結(jié)果比較(n)

2.3初診與復(fù)診患兒兩種檢測(cè)方法檢出率的差異 初診患兒的核酸檢測(cè)陽性率為33.8%，復(fù)診患兒的核酸檢測(cè)陽性率為16.9%，不同病程時(shí)期核酸檢出率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。初診患兒的抗體檢測(cè)陽性率為84.5%，復(fù)診患兒的抗體檢測(cè)陽性率為82.8%，不同病程時(shí)期血清學(xué)抗體檢出率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表3～4。

表3 初診與復(fù)診患兒的核酸檢測(cè)結(jié)果比較(n)

表4 初診與復(fù)診患兒的血清學(xué)抗體檢測(cè)結(jié)果比較(n)

3 討 論

手足口病發(fā)病率為37/100 000～205/100 000，病死率也較高，且近年來其發(fā)病率有逐年增長(zhǎng)的趨勢(shì)。手足口病能通過糞口途徑、呼吸道飛沫、接觸途徑傳播[5-6]。引發(fā)手足口病的腸道病毒有20余種，以EV71和CA16最為常見，EV71感染更被認(rèn)為是導(dǎo)致手足口病患兒死亡的最主要原因，其傳染性較強(qiáng)，能在短時(shí)間內(nèi)造成較大范圍的流行[7-8]，嚴(yán)重威脅兒童的生命健康。

采用膠體金法進(jìn)行血清學(xué)抗體檢測(cè)，具有操作簡(jiǎn)便易行、標(biāo)本可批量處理等優(yōu)點(diǎn)，在臨床上應(yīng)用較為廣泛，但其缺點(diǎn)在于檢測(cè)過程中會(huì)因存在抗體交叉反應(yīng)而出現(xiàn)較高的假陽性率，也可能受膠體金硝酸纖維素膜檢測(cè)線上包被的抗原種類限制以及體內(nèi)抗體滴度因素影響而出現(xiàn)假陰性。而SAT的優(yōu)點(diǎn)為檢測(cè)快速敏感，可早期診斷，并且可同時(shí)檢測(cè)EV71、CA16和腸道病毒通用型，對(duì)手足口病腸道病毒病原體各種常見亞型實(shí)現(xiàn)全覆蓋，是目前臨床實(shí)驗(yàn)室的主要檢測(cè)方法[9-10]。本研究對(duì)比兩種檢測(cè)方法的檢出率，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且病毒血清學(xué)抗體檢出率顯著高于腸道病毒核酸，二者吻合度和一致性不高。造成該現(xiàn)象的可能原因有以下3點(diǎn)：(1)患兒感染后血清抗體為非特異性的。(2)患兒感染其他亞型腸道病毒后，抗體在體內(nèi)存在時(shí)間較長(zhǎng)，會(huì)對(duì)結(jié)果造成影響。(3)膠體金法假陽性率較高。在進(jìn)行血清學(xué)抗體檢測(cè)時(shí)，兩種病毒血清學(xué)抗體初診檢出情況為CA16陽性183例，EV71陽性153例，2周復(fù)診時(shí)，CA16陽性207例,EV71陽性177例，復(fù)診陽性數(shù)均高于初診。一方面反映出抗體在體內(nèi)持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)，另一方面也提示初、復(fù)診均有部分標(biāo)本出現(xiàn)了EV71-IgM和CA16-IgM雙抗體陽性結(jié)果。這是由于EV71與CA16基因水平的同源性為77%，而氨基酸水平的同源性為86%[3,5]，因此筆者認(rèn)為此類標(biāo)本需要核實(shí)核酸檢測(cè)結(jié)果，才能明確具體病原體，以及是否為合并感染。由于實(shí)驗(yàn)室檢查的局限性和研究設(shè)計(jì)上的缺陷，本研究未對(duì)該類標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行鑒別。兩次檢測(cè)結(jié)果提示，病毒血清學(xué)抗體在體內(nèi)持續(xù)時(shí)間更長(zhǎng)，提示病毒血清學(xué)抗體檢測(cè)不利于判斷疾病恢復(fù)期病毒復(fù)制情況，也不利于判斷是否需要延長(zhǎng)隔離時(shí)間。

考慮到不同病程、不同標(biāo)本采集方法、病毒復(fù)制、排毒周期以及個(gè)體免疫差異等因素，單一的檢測(cè)方法均存在一定的局限性和漏檢情況。因此，在患兒患病早期或者免疫功能比較低下時(shí)，采用核酸與抗體聯(lián)合檢測(cè)的方式有助于提高早期檢出率[7,11]，最終實(shí)現(xiàn)預(yù)防感染和控制疾病流行的目的，為患兒的后續(xù)治療提供可靠依據(jù)。

重癥患兒癥狀緩解出院后或多數(shù)患兒在起病2周后，臨床癥狀已經(jīng)消失，但仍有部分患兒存在排毒的情況，提示有癥狀的患兒和無癥狀的康復(fù)期患兒均可能成為傳染源[12-14]，導(dǎo)致所在社區(qū)、學(xué)校的手足口病傳播與流行。因此，明確手足口病患兒的排毒時(shí)間，對(duì)防治手足口病具有重要意義。由于核酸檢測(cè)可以更加準(zhǔn)確地判斷疾病恢復(fù)情況，因此建議在恢復(fù)期進(jìn)行病毒的核酸檢測(cè)，有助于該病的防控工作。

4 結(jié) 論

EV71與CA16核酸與抗體檢測(cè)結(jié)果的一致性不高。抗體檢測(cè)存在交叉反應(yīng)陽性。核酸檢測(cè)有助于了解患兒恢復(fù)期病毒復(fù)制情況，對(duì)確定手足口病患兒在病程2周后是否仍需要延長(zhǎng)隔離時(shí)間以及準(zhǔn)確制訂隔離期具有較大意義。核酸與抗體聯(lián)合檢測(cè)可一定程度上避免單一方法檢測(cè)的局限性，有助于提高早期檢出率，為患兒的后續(xù)治療提供可靠依據(jù)。