新型冠狀病毒核酸和抗體檢測臨床應用專家共識

上海市醫學會檢驗醫學分會

當前，復工復產逐步推進,疫情境外輸入壓力不斷增大以及無癥狀感染者存在一定傳播風險等，這對新型冠狀病毒檢測工作提出了新的要求。上海市衛生健康委員會貫徹《關于進一步做好疫情期間新冠病毒檢測有關工作的通知》[1]精神，發布加強本市醫療機構新型冠狀病毒檢測工作的通知，強調結合國家聯防聯控機制文件,做好貫徹落實工作。文件指出，原則上二級以上綜合性醫療機構應當建立符合生物安全二級及以上標準的臨床檢驗實驗室，具備獨立開展新型冠狀病毒檢測的能力，常態化防控要提升檢測能力，大規模開展核酸和抗體檢測。這有利于精準防控，保障群眾健康，推動全面復工復產。要提高檢測技術水平，抓緊擴大更簡便、高效的檢測設備的生產規模和商業化應用，努力做到應檢盡檢、愿檢盡檢。這對諸多醫院檢驗科的檢驗流程、檢驗質量和生物安全提出了更高的要求。

本共識在上海醫學會檢驗醫學分會查閱文獻、咨詢相關專家的基礎上進行編寫，以對新型冠狀病毒臨床實驗室檢測、臨床應用和生物安全提供有指導性的建議。本共識適用于從事新型冠狀病毒核酸和血清抗體檢測的臨床實驗室，旨在規范新型冠狀病毒核酸和抗體的檢測方法與流程，為臨床提供規范可靠的檢測結果與合理的報告解讀。新型冠狀病毒是一個全新的病毒,人類對新型冠狀病毒的認識還在不斷深入，本共識將適時修訂，以適應臨床應用的需求。

1 標本采集

1.1核酸檢測標本 具體過程參照《新型冠狀病毒肺炎實驗室檢測技術指南》[2]，采集過程須兼顧安全和目標。在能夠達成目標的情況下，盡量減少接觸,盡量避免氣溶膠和飛沫產生,盡量縮短在床旁的持續時間。嚴格落實采樣人員個人防護措施，確保“一人一采一消毒”，并按規范做好場所消毒隔離、醫療廢棄物處置、剩余生物樣本處置等工作。(1)采集因素是造成核酸結果假陰性的重要原因，采樣人員應經過標準化培訓及考核。(2)輕癥患者、高度疑似患者或有密切接觸史者，核酸標本采集優先順序為鼻咽拭子、口咽拭子、痰液。為提高檢出率，可同時采集1份鼻咽拭子和1份口咽拭子于同一標本采集管中。采樣時應選擇有國家醫療器械注冊證、質量好的無菌植絨拭子，拭子的采集及保存方法應規范。推薦使用帶有異硫氰酸胍等病毒滅活劑的采樣管，滅活病毒的同時可提高檢出率。(3)為觀察治療期間的病毒清除效果，應收集標本并多次檢測。(4)新型冠狀病毒還會影響人體多個主要器官，可對疑似患者其他部位的體液(如腦脊液、血液等)進行檢測。

1.2抗體檢測標本 血清、血漿、靜脈全血標本都可以進行抗體檢測，成人建議采集3～5 mL全血以保證能分離獲得足量的血清。全血標本可直接使用乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝采血管。

2 標本送檢[3]

2.1核酸檢測標本 標本應送至具備檢測資質并經省級衛生健康行政主管部門批準，可從事新型冠狀病毒核酸檢測的聚合酶鏈反應(PCR)實驗室。

2.1.1送檢時間和溫度控制 (1)標本采集后應盡快送檢，建議標本采集后室溫放置不超過4 h，應盡可能在2～4 h送到實驗室。在2～8 ℃下轉運，運送時間一般不超過24 h(根據采集管中保存液的差異，最長不應超過72 h)。如超過72 h，應于-70 ℃或更低的溫度下保存和轉運。如果需要外送標本，建議采用冰袋或者干冰等制冷方式進行保存。(2)血液標本應分離血漿后進行保存和轉運。

2.1.2運輸容器 標本運輸容器應當防水、防破損、防泄露、耐高(低)溫和高壓。運輸容器和包裝材料上應有相關部門規定的生物危害標識、警示語和提示語。運輸容器應使用三層包裝系統，即內層包裝、中層容器和外層容器。防漏的內層包裝應貼上生物危害標識，每袋限1份新型冠狀病毒核酸標本，裝入中層容器，將“感染性物品”標記貼在外層容器上。內層包裝和中層容器間應放置足量的吸水性材料，中層容器應固定在硬質外層容器中。中層容器與外層容器間應放置冰袋。

2.1.3院內運輸 標本運送人員進行二級防護并隨身攜帶75%乙醇，以便發生意外時能及時處理。轉運期間應保持轉運箱平穩，標本直立不倒，避免劇烈震蕩、顛簸。轉運過程中運送人員不可自行打開轉運箱，不可直接接觸標本；轉運期間如果發生意外，如傾倒、泄漏等突發事件，不應自行處理轉運箱，須立即向有關部門匯報，由相關部門委派專業人員處理。條件允許時應配備標本轉運監控裝置。標本應單獨轉運，不能和其他物品混雜放置，禁止氣動系統轉運標本。

2.1.4長距離運輸 若標本需要長距離運輸，應當按照《可感染人類的高致病性病原微生物菌(毒)種或樣本運輸管理規定》[4]辦理《準運證書》。醫療機構等委托第三方醫學檢驗實驗室進行標本檢測，應由委托方負責辦理《準運證書》。新型冠狀病毒標本運輸包裝屬于A類，對應的聯合國編號為UN2814。轉運者安全防護按二級防護要求，并隨身攜帶75%乙醇。司機佩戴外科口罩或N95口罩，通過專用車輛運輸。如果經航空運輸，包裝還應符合國際民航組織文件Doc9284-AN/905《危險品航空安全運輸技術細則》的PI602分類包裝要求。至少由1名標本運送人員和司機同時轉運標本，宜配備標本轉運過程監控設施。標本應單獨轉運，不能和其他物品混雜放置，禁止氣動系統轉運標本。

2.1.5標本接收 在二級生物安全柜內完成標本接收。實驗室接收人員用0.55%及以上含氯消毒液或75%乙醇對轉運容器消毒。打開轉運容器后立即使用0.55%及以上含氯消毒液或75%乙醇噴霧，檢查轉運盒或者密封袋及標本的密閉性，核對標本信息，包括被檢者姓名、性別、年齡、編號及檢測項目等。待檢標本的狀態如有異常，需注明。

2.1.6標本保存 用于核酸檢測的標本應盡快進行檢測，能在24 h內檢測的標本可置于4 ℃保存；24 h內無法檢測的標本則應置于-70 ℃或以下保存(如無-70 ℃保存條件，則于-20 ℃冰箱暫存)。應設立專庫或專柜單獨保存標本，避免反復凍融；條件允許時應配備標本保存監控裝置。

2.1.7標本管理 新型冠狀病毒陽性標本應由專柜、雙人、雙鎖、專人管理，準確記錄標本的來源、種類、數量，編號登記，采取有效措施確保標本的安全，嚴防發生誤用、惡意使用、被盜、被搶、丟失、泄露等事件。條件允許時可配備標本保存監控裝置。

2.2抗體檢測標本

2.2.1送檢時間和溫度控制 標本采集后應30 min內送達實驗室，不宜超過2 h。標本抵達實驗室后，血清標本應盡快離心，避免溶血。

2.2.2標本保存 血清及全血標本如果在5 d內可完成檢測則保存于2～8 ℃，全血標本不得凍存。血清標本若5 d內無法檢測則應置于-70 ℃或以下保存，如無-70 ℃保存條件，則于-20 ℃冰箱暫存。標本避免反復凍融。條件允許時應配備標本保存監控裝置。

2.2.3運輸容器、院內及長距離運輸、標本接收和標本管理等要求 參見“2.1”項下內容。

3 標本檢測

3.1核酸標本檢測

3.1.1檢測方法 新型冠狀病毒常用的核酸檢測方法有兩種：病毒核酸特異基因檢測和病毒基因組測序。熒光PCR法是目前臨床上廣泛應用于新型冠狀病毒核酸檢測的方法，具有快速、靈敏、特異等特點。由于新型冠狀病毒是RNA病毒，試劑盒檢測基本都采用反轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)法，擴增病原體的核酸，同時通過熒光探針實時檢測擴增產物。

熒光PCR法基本原理是通過熒光標記的特異性探針，通過對反應過程中PCR產物的標記跟蹤，實時監測產物量的增長，根據擴增曲線計算出起始模板量。新型冠狀病毒核酸熒光PCR法檢測試劑盒檢測靶標主要分為病毒基因組中開放讀碼框1a/b(ORF1ab)、核殼蛋白(N)和包膜蛋白(E)。推薦選用至少包含針對新型冠狀病毒ORF1ab和N基因區域的試劑。

除熒光PCR法外，目前已獲批的新型冠狀病毒核酸檢測試劑盒采用的方法還有測序法、等溫擴增法、雜交捕獲免疫熒光法和RNA捕獲探針法。

基因測序技術在疫情初期甄別病原體起到了至關重要的作用，也為后續基因擴增檢測新型冠狀病毒的開展提供了特異性基因組序列信息。但基因測序存在儀器昂貴、操作復雜、耗時長、需要專業人員進行分析等不足，無法在臨床上大范圍推廣使用。基因測序可用于臨床高度疑似但RT-PCR檢測陰性患者的確認，同時也可進一步獲得病毒是否發生變異等信息，為后續的疫苗、藥物研發等提供數據。

等溫擴增法與傳統PCR法相比，技術設備簡單，擴增時間縮短，同時保持了較高的靈敏度及特異度，并能快速檢測，在病原體檢測及分子診斷中被廣泛應用。該技術擴充了新型冠狀病毒的檢測手段，但等溫擴增技術具有引物設計要求高、不能擴增較長目的片段、易產生假陽性結果等局限性，其在新型冠狀病毒的檢測中能否克服上述缺陷，達到快速、精準檢測的目的，仍有待于臨床進一步應用評估。

雜交捕獲免疫熒光法可快速檢測病原體核酸，無須核酸提取純化，無須PCR擴增，通過處理液直接裂解病原體并釋放靶核酸，靶核酸和探針形成DNA/RNA雜交體，熒光粒子對DNA/RNA雜交體進行熒光信號識別，實現對標本中目標核酸的定性判斷。

3.1.2核酸檢測過程的質量保證 經過衛生健康行政部門檢查認證通過，具備生物安全二級實驗室、臨床基因擴增檢測能力，滿足國家規定的開展新型冠狀病毒核酸檢測能力條件的醫療機構(含醫學檢驗實驗室)，可開展新型冠狀病毒核酸檢測服務。

目前使用的核酸檢測試劑盒有部分缺乏充分的臨床評估，臨床實驗室應選擇國家藥品監督管理局批準的試劑開展臨床檢測，并在正式使用試劑前進行性能驗證。在實際檢測中應嚴格按照操作規程，注意規范各種細節，避免假陰性及假陽性結果的產生，保證結果快速、準確。

3.1.2.1性能驗證 性能驗證參數至少包括精密度、符合率和檢出限，同時還需要在臨床檢測過程中累積室內質量控制和臨床標本檢測得到的數據，以及與其他實驗室間的結果進行對比，開展進一步的評價和其他性能指標的驗證(如特異度、抗干擾能力等)。通過性能驗證形成實驗室最優的檢測系統，建立具有可操作性的標準操作程序(SOPs)。

試劑和關鍵耗材(離心管、吸頭等)在正式用于常規檢測前，應進行耗材質檢。使用的關鍵耗材應不含抑制物，僅使用帶濾芯的吸頭。試劑及關鍵耗材更換批號時，實驗室應對新批號的試劑和關鍵耗材進行批間差異的質量檢驗。不同批號試劑間的差異驗證，建議選擇陰性(2份)和陽性(3份，其中至少1份是弱陽性)的樣品，使結果符合預期。

3.1.2.2室內質量控制 開展新型冠狀病毒感染檢測的實驗室必須建立健全生物安全防范、技術操作規程、質量保證措施及結果報告的規范。每批檢測至少包括1份弱陽性質控品(通常為檢測限的3倍)和3份陰性質控品(通常2份為試劑盒自帶陰性質控品，1份為生理鹽水標本)，質控品應隨機放在臨床標本中參與從提取到擴增檢測的全過程。弱陽性質控品測定應為陽性，3份陰性質控品應全部為陰性，視為在控。反之，則為失控，不可發出報告，應及時分析原因，必要時重新檢測標本。當臨床陽性標本不易獲得時，可使用質控品稀釋。每次檢測后，記錄弱陽性質控品檢測的循環閾值(Ct值)。

對所用儀器(生物安全柜、提取儀和擴增儀等)按要求進行驗證和校準，對儀器(如涉及2臺或以上儀器)、人員(所有檢測人員)、方法(如涉及2種不同試劑/方法)和試劑(不同批號間)進行實驗比對。

建議每次試驗帶入1份生理鹽水/焦碳酸二乙酯(DEPC)處理水，開蓋放置在提取儀或操作臺面上過夜，用于環境污染的評估。建議選擇能監控從采樣、提取、反轉錄到擴增整個實驗過程的試劑。如擴增人核糖核酸酶(RNase)P基因作為內部對照，以避免標本因采樣問題(如拭子未刮到上皮細胞)或實驗操作不當(如保存、運輸不當，核酸提取過程中的RNA降解等)引起假陰性結果。建議弱陽性標本應至少用2個廠家的試劑復核，以保證結果的準確性。

3.1.2.3室間質量控制 每家檢測機構保證首次開展新型冠狀病毒核酸檢測前參加1次室間質評和生物安全督導，并合格；以后必須定期(至少每年1次)參加上海市或其他省級以上臨床檢驗中心組織的室間質評和生物安全督導，并合格。檢測機構室間質評和生物安全督導結果不合格，不允許開展新型冠狀病毒檢測。

3.1.3結果報告 應根據試劑說明書判讀結果。如檢測結果為陰性，檢測機構告知被檢測人員或單位檢測結果，并出具檢測報告。檢測報告應統一備注：“檢測結果僅適用于此次采集標本。單次核酸檢測陰性不能完全排除新型冠狀病毒感染”。如檢測結果為陽性，檢測機構應立即報告所在地區疾病預防控制中心，將陽性標本送至疾病預防控制中心復核；同時，聯系陽性結果人員，協調安排急救車輛將其轉送至醫療機構發熱門診隔離觀察，按照規范流程和要求進行進一步診治排查。根據《臨床基因檢驗診斷報告模式專家共識》[5]及我國臨床實踐現狀，核酸檢測結果應包括定性結果[(陽性/陰性)或(檢出/未檢出)]、方法學、檢出限及必要的臨床建議。

3.2血清抗體檢測 新型冠狀病毒肺炎發病3～5 d后，血清特異性抗體逐漸產生，首先出現的是IgM抗體，然后出現IgG抗體。《新型冠狀病毒肺炎診療方案(試行第七版)》[6]明確將抗體檢測結果納入確診病例的診斷標準，以及疑似病例的排除標準。如果疑似病例血清特異性IgM和IgG抗體陽性，IgG抗體由陰性轉為陽性或恢復期較急性期有4倍及以上升高，則可以診斷其感染了新型冠狀病毒。疑似病例的排除標準：需要同時滿足病毒核酸檢測結果陰性，以及發病7 d后新型冠狀病毒IgM和IgG抗體仍為陰性兩個條件。

有些患者無法觀察到新型冠狀病毒IgG抗體出現4倍及以上升高，這可能與檢測抗體時已進入了IgG抗體平臺期有關。因此，對這些患者建議結合流行病學史、臨床癥狀和影像學檢查來綜合判斷。

3.2.1檢測方法 目前檢測抗體常用的方法有酶聯免疫吸附法、膠體金法、化學發光法等。目前已獲得國家藥品監督管理局批準的新型冠狀病毒IgM/IgG抗體檢測試劑盒主要基于膠體金法。肢體金法無須對標本進行特殊處理，僅需少量血液標本即可在15 min內通過肉眼觀察到檢測結果，突破了人員、場地對現有檢測技術的限制，縮短了檢測時間，操作方便快速，成本較低，應用范圍廣，適合在基層醫療單位及現場檢測中廣泛使用，但無法滿足高通量檢測的要求，且無法定量，檢測靈敏度也低于其他兩種方法。

磁微粒化學發光法檢測IgM/IgG抗體和酶聯免疫吸附法檢測N蛋白的試劑盒也通過了審批。酶聯免疫吸附法的靈敏度較高，載體標準化難度較低，但檢測速度慢、易污染、步驟較為煩瑣。磁微粒化學發光法具有操作方便、靈敏度高、特異性強、結果準確性高且穩定、自動化程度高和檢測速度快等優點，同時試劑無放射性污染，適合高通量檢測，但成本相對較高，依賴于大型儀器設備。

3.2.2抗體檢測過程的質量保證

3.2.2.1性能驗證 性能驗證參數至少包括精密度、符合率和檢出限，同時還需要在臨床檢測過程中累積室內質控和臨床標本檢測得到的數據，以及與其他實驗室間的結果進行對比，開展進一步的評價和其他性能指標的驗證(如精密度、符合率等)。通過性能驗證形成實驗室最優的檢測系統，建立具有可操作性的SOPs。

3.2.2.2質量控制 建議每批檢測設立1個陽性質控、1個陰性質控。陽性質控檢測為陽性，陰性質控檢測為陰性，視為在控。反之，則為失控，不可發出報告，應分析原因，必要時重新檢測標本。對所用儀器進行驗證和校準，對儀器(如涉及 2 臺或以上儀器)、人員(所有檢測人員)、方法(如涉及 2 種不同試劑/方法)和試劑(不同批號間)進行實驗比對。建議弱陽性標本應至少用2個廠家的試劑復核，盡可能使用包被抗原基本一致的試劑盒。若包被抗原不一致，檢測結果可能有所不同，例如包被S、N或S+N的不同，檢測結果有可能不一致。

3.2.3核酸、抗體聯合檢測的結果報告 新型冠狀病毒肺炎發病3～5 d后，血清特異性抗體逐漸產生，首先出現的是IgM抗體，然后出現IgG抗體。因此，IgM抗體陽性提示近期急性感染，IgG抗體陽性提示既往感染。血清特異性抗體陽性并不能說明患者沒有傳染性，其體內還可能有少量病毒復制。因此，抗體的出現不能作為出院的標準，抗體在疾病痊愈后可以維持很長時間。抗體檢測主要用于回顧性診斷以及對核酸檢測結果存疑時的輔助診斷，不能用于新型冠狀病毒肺炎的確診和排除，僅在無法使用RT-PCR時才建議使用血清學抗體進行診斷，不適用于一般人群的篩查。

IgM/IgG抗體初次檢測可能出現的結果有IgM(+)/IgG(-)、IgM(+)/IgG(+)、IgM(-)/IgG(+)和IgM(-)/IgG(-)4種模式，可按表1所示流程進行檢測以判斷患者是否為急性或近期感染。

表1 新型冠狀病毒核酸與抗體檢測結果解讀

核酸陰性結果也不能排除新型冠狀病毒感染，需要排除可能產生假陰性的因素，包括：(1)標本質量差，比如口、咽等部位的呼吸道標本；(2)標本收集的過早或過晚；(3)沒有正確保存、運輸和處理標本；(4)技術本身存在的原因，如病毒變異、PCR抑制等。

抗體檢測可能會因為標本中存在干擾物質(如類風濕因子、異嗜性抗體、補體、溶菌酶等)、標本溶血、標本被細菌污染、標本凝固不全殘留有纖維蛋白原等因素影響而出現“假陽性”結果。同時，由于血清學方法存在一定的窗口期以及檢測試劑盒靈敏度不同也會出現“假陰性”結果。因此，抗體檢測必須采用IgM和IgG抗體同時檢測的方法且通常需多次(2次以上)檢測確認。

核酸和抗體檢測結果不能作為新型冠狀病毒肺炎確診和排除的唯一依據，應結合患者流行病學史、臨床癥狀和其他實驗室檢查結果綜合判斷。

4 生物安全要求[7]

4.1病毒核酸檢測 病毒核酸檢測應在二級生物安全及以上實驗室開展。

4.1.1一般患者(感染新型冠狀病毒的概率較低) 采樣者須二級生物安全防護。

4.1.2疑似患者 采樣者應采用三級生物安全防護，實驗室按國家相關規定做好生物安全方面的工作。操作不開蓋的血常規、血清學標志物等檢測項目時，實驗室人員至少采用二級生物安全防護；進行核酸檢測必須采用三級生物安全防護。

4.1.3確診患者 采樣和檢測人員應采用三級生物安全防護，實驗室按國家相關規定做好生物安全方面的工作。實驗室接收和處理標本應進行三級生物安全防護，手工檢測的項目應在生物安全柜中進行。進行核酸檢測必須采用三級生物安全防護。

4.2實驗室清潔消毒

4.2.1實驗室空氣消毒 實驗室每次檢測完畢后，應進行紫外線消毒至少30 min。

4.2.2工作臺面、地面消毒 每天檢測后使用0.55%及以上含有效氯的消毒液進行臺面、地面消毒。垃圾桶及垃圾袋應噴灑0.55%及以上含有效氯的消毒液。

4.2.3生物安全柜消毒 每天檢測后用75%乙醇對生物安全柜進行擦拭。配置紫外燈的生物安全柜，每次檢測完畢后，應進行紫外線消毒至少30 min。沒有配置紫外燈的生物安全柜，實驗結束后，風機開啟30 min后關閉。

4.2.4轉運容器消毒 轉運及存放標本的容器使用前后用0.55%含有效氯的消毒液或75%乙醇進行擦拭或噴灑消毒。

4.2.5離心機 標本離心無意外情況發生，離心停止10 min以上，開離心機蓋用0.55%含有效氯的消毒液或75%乙醇進行擦拭或噴灑消毒。

4.2.6標本銷毀 完成檢測后，標本應在生物安全柜中重新加蓋或塞子(新的)，按規定保存。檢測結果陰性的標本，保存2周后高壓滅菌銷毀并做好消毒、銷毀記錄。標本經高壓滅菌處理后應符合生物安全要求，符合感染管理規范。廢棄物管理見《新型冠狀病毒實驗室生物安全指南(第二版)》[8]。

4.2.7檢測結果陽性的標本 在完成檢測工作后應對剩余標本執行雙人、雙鎖、專柜、超低溫暫時保存并配備探頭監視；及時通知上級疾病預防控制中心檢測部門，聯系取樣和復檢工作。