全切片圖像掃描技術在病理切片質控中的作用

唐仲平 崔權哲 包 驥 蔡 瑋 趙 春▲

1.成都市第一人民醫院病理科，四川成都 610041；2.成都市第三人民醫院病理科，四川成都 610014；3.四川大學華西醫院病理研究室，四川成都 610041；4.四川省雅安市名山區人民醫院病理科，四川雅安 625100

數字病理核心是將傳統病理圖像電子化和網絡化，其關鍵技術包括全切片圖像掃描技術（whole slide images，WSI）、圖像分析信息學、信息管理系統和數字化體外診斷（IVD）設備。目前，數字病理的用途主要包括四類：教學[1-2]、診斷[3-8]、研究和檔案保存[9]。數字病理剛興起時由于掃描慢、圖像差、傳輸慢、存儲貴，只用于部分病理教學實踐及少數疑難病例或術中冰凍的遠程會診[10-11]。然而以上幾點技術因素在最近均獲得了顯著進步，所以數字病理在近年推廣至日常臨床診斷是可行的[12-14]。利用WSI技術將每天產生的所有切片掃描形成數字化切片。本研究以成都市第一人民醫院病理科日常工作中連續診斷的300 例組織學病例為對象，由作者在電腦屏幕上閱讀數字化切片并評估掃描效果，回顧性分析WSI 技術在日常病理切片的數字化掃描中的應用效果及本科室HE 切片的主要質量缺陷，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

經醫院醫學倫理委員會審核批準，本研究選取成都市第一人民醫院病理科300 例[共計493 張病理切片：384 張蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色切片，57 張亞甲基藍染色切片，52 張免疫組化染色切片]由作者于2015 年9 月診斷的連續組織學病例為研究對象，其中男115 例，女185 例，年齡10 ～92 歲，平均（45±15）歲。

表1 病理常規石蠟包埋HE染色切片質量標準及評分[15]

圖1 WSI 技術掃描不同類型的切片得到的數字化圖像

1.2 病理檢查

本研究病例來自消化系統155 例（60 例胃鏡，33 例腸鏡，62 例開展其他方式檢查），乳腺及女性生殖系統82 例（13 例乳腺，4 例子宮，27 例宮內膜，20例宮頸及宮頸管，8 例輸卵管，3 例卵巢，2 例外陰，5 例胎盤），皮膚34 例，軟組織與骨10 例，泌尿系統與男性生殖器官7 例，頭頸部7 例，造血與淋巴組織3 例，肺、胸膜、胸腺及心臟2 例。

1.3 方法

將病理切片運用Aperio 全自動數字切片掃描系統（美國Aperio Technologies 公司）掃描成數字化切片（20 倍物鏡）。按照HE 切片評分標準對數字化切片做出質量評分。見表1。

2 結果

2.1 WSI技術掃描前及掃描中發現的問題及應對措施

在掃描切片前的提片過程中，作者發現2 張粘連的切片和1 張缺失的切片。對此，作者將2 張粘連的切片放入二甲苯中浸泡過夜，第二天將其分離并去除蓋玻片后重新封片；對于缺失的切片作者提取其原始蠟塊重新切片。493 張切片備齊后，作者在掃描過程中發現5 張切片因自動對焦失敗而無法掃描。對此，作者在病理組織上手動選取4 個以上焦點來解決該問題。

表2 HE切片的十項優質標準的得分

2.2 WSI技術的掃描優良率

在用WSI 技術掃描的493 張病理切片中，共有50 張切片的掃描質量存在不同程度的問題，總體掃描優良率為89.86%（443/493）。常規HE 染色切片、亞甲基藍染色切片及免疫組化染色切片的掃描優良率分別為89.58%（344/384）、85.96% （49/57）及96.15%（50/52）。見圖1。

2.3 WSI技術的掃描不良原因及應對措施

筆者將掃描不良的50 張病理切片的原始切片提出來觀察，將掃描不良的原因分為五大類：切片不整潔、封片劑收縮、切片裱貼位置不當、切片過厚和掃描機原因，它們在掃描不良的切片中占的比重分 別 為44.00%（22/50），22.00%（11/50），10.00%（5/50），6.00%（3/50），18.00%（9/50）。針 對 上 述五類問題，作者采取了擦拭灰塵，重新封片，重切薄片和調試機器等措施，結果50 張切片重新掃描后全部得到了清晰的數字化圖像。

2.4 我科HE切片的優良率

筆者將384 張HE 切片按照HE 染色切片質量標準及評分表的十項標準依次評分，計算出最終得分，并按照切片質量分級標準進行分級。結果發現，我科沒有不合格HE 切片且切片的總體優良率較高（99.74%），其中評“優”率為94.27%（362/384），評“良”率為5.47%（21/384），僅有的1 張評“基本合格”的HE 切片來自造血和淋巴系統。評“良”的21 張HE 切片分別來自乳腺及女性生殖系統（38.09%，8/21：宮內物4 張，胎盤2 張，宮頸1 張，輸卵管1 張），皮膚（19.05%，4/21），消化系統（14.29%，3/21），泌尿系統與男性生殖器官（14.29%，3/21），頭頸部（9.52%，2/21），造血與淋巴系統（4.76%，1/21）。

2.5 我科HE切片的主要質量缺陷

我科384 張HE 切片的得分范圍在74 ～100分之間，平均得分為96.269 分，平均扣分為3.731分。按照HE 染色切片質量標準，我科HE 切片的十項優質標準的得分情況見表2。其中，單項平均扣分/總平均扣分大于10.00%的因素包括以下四項：刀痕或裂隙（35.03%），皺褶或折疊（17.45%），切片松散或裱貼位置不當（13.61%），切片厚或厚薄不均（12.09%）。

為了進一步分析我科HE 切片的主要質量缺陷，作者將HE 染色切片質量標準及評分表中的質量缺陷減分進一步拆分成十八個減分項目。如表3 所示，384 張HE 切片共計扣分為1433 分，按所扣分數的多少排序，五個主要的扣分原因依次為裂隙（26.80%），折疊（14.65%），切片裱貼位置不當（9.77%），刀痕（8.23%），切片厚薄不均（7.26%）。如表4 所示，384 張HE 常規病理切片共計扣分項目為519 項（注：同一張切片可有多個項目被扣分），按照扣分項目的多少排序，五個主要的扣分原因依次為裂隙（36.99%），折疊（20.23%），刀痕（11.37%），切片裱貼位置不當（5.39%）， 切片厚薄不均（5.01%）。綜合表3 ～4 的數據，我科HE 切片的主要質量缺陷集中在裂隙，折疊，刀痕，切片裱貼位置不當和切片厚薄不均五個問題上。

3 討論

與傳統病理相比，數字病理運用大數據手段促進病理學研究[16-19]。只有數字病理進入日常病理診斷工作，那臨床的大數據研究才得以開展。但目前國內外的數字切片并未真正用于病理科日常診斷工作，病理醫生依然習慣在顯微鏡下而非電腦屏幕上進行診斷，這使得病理學的發展很難廣泛利用現在蓬勃發展的信息技術。本研究運用WSI 技術將300 例連續的組織學病例的病理切片進行數字化掃描，并由作者閱讀數字化切片評估掃描效果，分析WSI 技術在日常病理切片的數字化掃描中的應用效果。

表3 HE切片所扣分數的分布情況

表4 HE切片扣分張數的分布情況

在切片提取過程中，作者發現兩個問題：（1）有2 張相鄰切片因封片膠過多，而檔案管理員在切片未充分干燥時就將切片重疊放在切片柜中而導致切片粘連，無法分開；（2）有1 張切片因未及時歸檔或歸檔錯誤，導致無法在相應位置找到切片。這反映了檔案管理員在歸檔病理資料時的工作疏忽。雖然數量不多，但以后檔案管理員一定要在切片充分干燥后將病理切片及時正確地歸檔。

在掃描過程中，作者發現5 張切片因組織太小導致焦點數目少于4 個，或焦點選在錯誤的位置（非有效區域）而不在組織上，掃描機無法自動對焦而掃描失敗。最主要的原因是臨床醫生取材過少，所以病理科要經常與臨床科室聯系，請臨床醫生盡可能取足夠的組織供病理醫技人員制片和診斷。其次，可能是病理技師包埋方向不當或修片不夠，未將組織最大面完整地展示出來，所以病理醫生閱片時若發現組織過小，要請病理技師重新包埋組織或深修蠟塊，以暴露組織的最大面。

在用WSI 技術掃描的493 張病理切片中，共有50 張切片的掃描質量存在不同程度的問題，原因有五大類。（1）切片不整潔：切片上灰塵過多，而灰塵跟病理組織不在同一個平面，導致掃描機將灰塵聚焦掃描，而病理組織成像卻模糊不清；（2）封片劑收縮：技師封片時滴加封片膠過少，導致封片膠回縮，而掃描機掃描的是組織的單一層面，導致封片膠收縮的區域掃描不清；（3）切片裱貼位置不當：病理切片分為正反兩面，正面的右側為可以做標記的磨砂面，而反面為光滑面。技師撈片時應當將石蠟片貼在正面，封片后在正面右側的磨砂面貼上病理標簽。但偶爾技師在撈片時不慎將石蠟片貼在光滑的反面，封片時卻在沒有病理組織的正面蓋上蓋玻片，貼上病理標簽。而作者往掃描機里裝載切片時是根據標簽來判斷切片正反，所以這些撈片錯誤的切片被掃描的是沒有病理組織的正面，自然不能得出清晰的圖像；（4）切片過厚：細胞重疊，精細的細胞形態難以看清；（5）掃描機原因：傳統病理切片并無質量問題，但掃描得出的數字化切片上卻出現一些明暗相間的條帶，這種情況多出自掃描機自身原因。其中，切片不整潔、封片劑收縮、切片裱貼位置不當這三種原因對數字化切片質量的影響是極大的，會導致病理醫生無法根據數字化切片做出診斷；而切片過厚和掃描機原因會導致病理醫師在診斷時花費更多時間，診斷正確率也會有所下降。

針對上述五類問題，作者采取了以下措施。（1）對于不整潔的切片，用干凈的棉布蘸適量的無水酒精將灰塵擦拭干凈；（2）對于封片劑收縮的切片，將其放入二甲苯中浸泡過夜，第二天去除原蓋玻片后重新封片；（3）對于裱貼位置不當的切片，將其放入二甲苯中浸泡過夜，第二天去除原來在載玻片正面的蓋玻片后，重新在載玻片反面的組織上重新封片。值得注意的是，切忌保留原來在載玻片正面的蓋玻片，而直接在載玻片反面的組織上重新封片。雖然這樣的切片在顯微鏡下可以看清，但整個切片太厚，會導致切片無法插入掃描儀的切片槽，或者掃描厚切片時直接導致機器故障；（4）對于切得過厚的切片，提取原始蠟塊重新切薄片；（5）對于掃描儀自身造成的問題，聯系工程師對掃描儀進行調試校準。經過上述處理后，作者將掃描不良的50 張切片重新掃描，全部得到了清晰的數字化圖像。實際上，前四種原因是可以通過病理科醫技人員自己控制和避免的，只有第五種的掃描機原因對于病理科工作人員算是一個相對的不可控因素。而493張切片中只有9 張切片（1.83%）是由于掃描機原因而導致掃描質量不佳，這說明運用WSI 技術對日常病理切片進行數字化掃描有著較高的成功率和可行性。

另外，作者還用WSI 技術形成的數字切片進行HE 切片的質控。結果發現我科HE 切片有著較高的優良率（99.74%），僅有1 張基本合格切片，沒有不合格切片。那么我科以后的主要目標是將評“良”的切片提升為評“優”的切片。評“良”的切片主要來自：乳腺及女性生殖系統8 張（其中4 張為宮內物）和皮膚4 張，那么宮內物和皮膚是我科制片的難點。宮內物切片不理想的主要原因是病理醫生在一個取材盒里裝入的組織太多，導致組織脫水不良，技師包埋困難，切片時難以得到完整的組織切面。所以，病理醫生應當將宮內膜適量分裝在多個取材盒里。而皮膚的組織結構復雜，硬度不一，韌性較大，在切片中常會出現皺褶，脫片等現象，病理醫技人員應當優化從取材到制片的整個流程。

本研究還發現，我科HE 切片最常見的質量缺陷包括裂隙，折疊，刀痕，裱貼位置不當和切片厚薄不均五個方面。下面依次分析這些問題出現的原因，探討解決措施。首先，裂隙的產生主要是因為組織處理的問題。以前我科只有一臺全封閉式全自動脫水機，只能將所有標本混合處理，難免會出現標本處理不均的現象。要么大的組織處理不足，要么小的組織處理過度。切片的裂隙多出現在固定不好、偏小、偏薄的組織，特別是細胞成分過多、含水量少的組織易被處理過度，導致質地硬脆。目前，我科已引進一臺快速脫水機專門用于小組織的處理，相信這種大小標本分開處理的方式會大大減少裂隙的產生。另外，裱片的水溫過高，切片還來不及伸展，切片的石蠟就已經融化，也會導致組織切片出現人為的裂隙。第二，折疊的產生多因裱片的水溫過低，切片在水中伸展不開。因此，要將裱片的水溫控制在45 ～ 47℃，減少切片人為裂隙和折疊的產生。另外，技術員的展片不佳也是折疊產生的一個重要原因，因此技術員應當多練習來提升自己的技術水平。第三，刀痕的出現可能是由于切片時刀座不穩、使用的一次性刀片松動、切片刀鈍、切片角度過于傾斜和切片動作太快太猛等，造成切片時組織出現震顫。所以技術員在每次切片前要仔細檢查機器，擰固刀座，夾緊刀片，調整并固定切片的角度。第四，裱貼位置不當主要是由于病理醫生取材時組織取得過大以及技術員的責任心不夠。只要病理醫生取材時掌握好取材的大小和厚度，技術員裱片時將組織片放到玻片中央即可。第五，切片厚薄不均多因切片刀不夠鋒利或切片機準確度不高、組織脫水不理想。切片過厚會導致脫片、脫蠟困難、染色過深，而切片過薄會導致染色過淺。所以技術員切片前應選擇鋒利的切片刀，平時勤保養切片機，保持切片機的最佳狀態；經常更換脫水液，保持溶液的有效濃度和成分。

更重要的是，本研究發現了很多利用數字化切片做質控優于傳統質控的地方。第一，傳統切片的每次質控工作都需要將原始玻璃切片從切片夾中找出，閱片后還需將切片歸檔，即耗時，又有損壞原始切片的風險；而數字化切片一旦形成，可隨時觀看，一勞永逸。第二，傳統切片的質控工作必須依賴顯微鏡進行，一般只有在病理科才能進行；而數字化切片形成后可經網絡上傳到云端，所以只要有電腦和網絡的地方都可以完成數字化切片的質控。第三，由于傳統原始切片只有一張，一般同一時間只能一個人對一張切片進行質控，即使有多頭顯微鏡，同時進行質控的人數也有限制；但數字化切片可以無限拷貝，可以多人在不同的電腦上同時觀看進行質控。第四，傳統切片隨著時間的延長，部分切片會出現褪色的現象，會影響質控的評分；而數字化切片一旦掃描，永不褪色，無論是對日后的復診和質控都大有益處。第五，傳統切片如果要用來參與室間質控，需要郵寄原始切片，即費時，又費錢；而數字化切片可經網絡快速傳輸到相關單位，無論是效率還是經濟性都優于傳統切片。

總之，本研究論證了WSI 技術在常規病理切片的數字化掃描及質量控制工作中的可行性以及優勢。相信在不久的將來，隨著數字病理進入日常病理工作技術條件的日益成熟，“互聯網+”全數字病理科將是未來病理科發展的必然趨勢[20-22]。