形態學評分相近的單囊胚復蘇移植選擇策略

黎佩怡 陳志云

廣東省惠州市中心人民醫院生殖醫學中心，廣東惠州 516000

在體外受精-胚胎移植技術中，囊胚培養是世界公認篩選最具有活力胚胎的方法，對第三天胚胎行囊胚培養后移植可提高種植率和妊娠率[1]。此外，囊胚移植被認為可以更好地協調胚胎發育與子宮內環境的同步[2-3]。基于這些研究，選擇性單囊胚移植逐漸成為一種保證高臨床妊娠率并且降低多胎妊娠率的方法。自囊胚培養技術發展至今，由Gardner 和 Schoolscraft 建立的囊胚形態學評分標準被胚胎學家應用于挑選最有種植潛力的囊胚[4]。根據該評分標準，每一個囊胚的擴張程度分為1 ～6期，內細胞團和滋養層細胞則根據細胞的大小和緊密程度分為A、B、C 三級。但在囊胚形態學評分類似的情況下，如4AB 和4BA，臨床醫生和胚胎學家面對的問題是：哪個才是最佳囊胚？然而，對于優先考慮內細胞團還是滋養細胞層的評分，目前國內外研究尚無定論[5-6]。本研究探討在復蘇周期中如何選擇形態學評分相近的單囊胚，為未來選擇性單囊胚移植策略提供臨床依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料

從本院生殖醫學中心的輔助生殖管理系統數據庫導出2014 年1 月～2020 年1 月進行的單個四期囊胚移植復蘇周期共810 個，回顧性分析患者臨床資料。患者納入標準：（1）年齡＜40 周歲；（2）復蘇后完全存活并在移植前擴張為四期的單個囊胚；（3）子宮內膜厚度為7 ～14mm。排除標準：（1）雙囊胚移植；（2）新鮮囊胚移植周期；（3）囊胚復蘇后有細胞裂解并導致評分降低的周期；（4）失訪的移植周期。

1.2 囊胚培養

所有研究對象的超促排卵方案按本中心常規方法進行。在B 超引導下進行取卵手術，獲卵后通過常規體外受精或單精子卵胞漿內注射進行授精。授精后第三天根據胚胎形態學評分進行新鮮胚胎移植或冷凍，患者簽署知情同意書后剩余胚胎行囊胚培養。

1.3 囊胚形態學評分

本中心使用的囊胚形態學評分方法同Gardner 和Schoolscraft 的評分方法[4]。根據囊胚的擴張程度分為1 ～6 期，內細胞團和滋養細胞層的數量和形態分級為：A.細胞數目多且排列緊密；B.細胞數目較少且排列松散；C.細胞數目很少。

1.4 囊胚玻璃化冷凍與復蘇

研究期間囊胚冷凍與復蘇所使用的冷凍液、復蘇液和載桿購買自瑞典Vitrolife 公司產品。囊胚冷凍之前通過激光進行人工皺縮，移入Vitri 1TM Blast 溶液中停留10min，再移入Vitri 2TM Blast 溶液中2min，在還有30s 結束時，將20μL Vitri 3TM Blast 溶液滴于無毒培養皿表面，當還有10s 結束時，收集囊胚并將其移至Vitri 3TM Blast 溶液液滴中，再將囊胚注入Rapid-iTM 載桿孔中，封口后移到液氮里保存。囊胚復蘇時將Rapid-iTM 載桿取出并將其空洞置于Warm 1TM Blast 溶液中2min，將囊胚移至Warm 2TM Blast 溶液中3min，將囊胚移至Warm 3TM Blast 溶液中10min，將囊胚轉移至相應的移植皿中等待移植。

1.5 復蘇周期內膜準備與囊胚移植

患者提前進行自然周期或人工周期準備子宮內膜。囊胚復蘇后2h 觀察形態，囊胚腔重新擴張且評分不變的情況下，在B 超引導下行囊胚移植。

1.6 妊娠結局的判斷

囊胚移植術后14 ～16d，電話隨訪其血清β-HCG 試驗結果，若β-HCG 隔天快速下降且B超未見胎囊，可判斷為生化妊娠；術后30 ～35d 行B 超檢查，可見胎囊，判斷為臨床妊娠；若在妊娠12周內自然流產，判斷為早期自然流產。

1.7 統計學方法

根據不同的統計類型，應用SPSS20.0 軟件進行χ2檢驗或t 檢驗，P ＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 單個四期囊胚移植的妊娠結局

共復蘇810 個周期，復蘇率和存活率均為100%，移植前觀察所有囊胚的囊胚腔均擴張為四期。其中435 例獲得臨床妊娠，臨床妊娠率為53.7%，生化妊娠率為9.4%，早期流產率為14.9%。

2.2 形態學評分相近的囊胚對妊娠結局的影響

形態學評分相近的囊胚（4AB 組與4BA 組、4BC 組與4CB 組）患者的基本情況分析顯示，年齡、BMI、基礎FSH 水平、獲卵數、授精方式、內膜厚度、復蘇周期的內膜準備方案和D5/D6 囊胚比例的比較差異均無統計學意義（P ＞0.05）。見表1 ～2。4AB 組與4BA 組的妊娠結局分析顯示，臨床妊娠率（66.7% vs 66.1%）、生化妊娠率（4.2% vs 5.1%）和早期自然流產率（11.5% vs 10.8%）比較差異均無統計學意義（P ＞0.05），見表3。4BC 組與4CB 組的妊娠結局分析顯示，4CB 組的臨床妊娠率顯著高于4BC 組（51.4% vs 39.7%，P=0.013），而生化妊娠率（14.1% vs 11.7%）和早期自然流產率（18.2% vs 18.9%）比較差異均無統計學意義（P ＞0.05）。見表3。不同級別的內細胞及滋養細胞形態學評分見圖1。

2.3 優質囊胚與非優質囊胚對妊娠結局的影響

優質囊胚組（4AB+4BA）和非優質囊胚組（4BC+4CB）的妊娠結局比較顯示，優質囊胚組的臨床妊娠率顯著高于非優質囊胚組（66.6% vs 44.9%）、生化妊娠率（4.4% vs 12.9%）和早期流產率（11.4% vs 18.5%）均顯著低于非優質囊胚組（P ＜0.05）。見表4。

3 討論

3.1 囊胚形態學評分對妊娠結局的影響

隨著體外囊胚培養體系的日趨成熟，囊胚培養成為了國內外大部分生殖醫學中心的主要胚胎培養技術之一。在患者的可利用胚胎較多的情況下，臨床醫師和胚胎學家會建議患者進行囊胚培養，以篩選最有種植潛能的胚胎。通過形態學評分，將內細胞團和滋養細胞層的評分達到A/B 級的單個囊胚作為移植首選，已成為一種提高臨床妊娠率和活產率的方法[1，7-8]。本研究選取了囊胚腔擴張程度為四期的單囊胚復蘇移植周期，并在移植前擴張至四期，排除了囊胚腔擴張程度這一干擾因素，可更好的評價內細胞團和滋養細胞層的重要性。

表1 4AB和4BA單囊胚移植患者基本資料比較

表2 4BC和4CB單囊胚移植患者基本資料的比較

圖1 不同級別的內細胞及滋養細胞形態（×400）

表3 四組囊胚的妊娠結局比較[n/n（%）]

3.2 形態學評分相近囊胚的選擇策略

囊胚的內細胞團和滋養細胞層在胚胎發育和種植過程中各司其職，缺一不可。內細胞團發育為胎兒，滋養細胞層發育為胎盤。在單囊胚移植挑選中，如何選擇形態學評分相近囊胚是臨床醫師和胚胎學家面對的日常問題。本研究表明，4AB 和4BA囊胚移植的妊娠結局相似，兩組臨床妊娠率均達到較高水平（均＞66%），而生化妊娠率和早期流產率較低。然而，4BC 和4CB 囊胚比較，4CB 囊胚的臨床妊娠率顯著高于4BC 組，并且生化妊娠率和早期流產率相仿。本研究結果顯示，由于優質囊胚（4AB和4BA）的整體評分高，內細胞團和滋養細胞層均具有較高的種植潛力，因此4AB 和4BA 兩組的妊娠結局相似。而對于非優質囊胚而言，滋養細胞層對臨床妊娠的影響更大，提示滋養細胞層在囊胚種植早期階段發揮重要作用相關。研究表明，只有囊胚種植在子宮內膜上，才有可能提供營養給胎兒后續的發育[9]。目前有關囊胚的內細胞團或滋養細胞層對預測妊娠結局的價值存在眾多爭議。國內學者汪彩珠等[10]報道在凍融單囊胚移植周期中，當囊胚評級≥BB 級時，因其臨床結局相似，均可考慮施行單囊胚移植。夏夢等[5]的研究表明，相對于內細胞團的級別，隨著滋養細胞層評分增高，臨床妊娠率和活產率顯著增高，而流產率顯著降低；尤其對于優質囊胚而言，滋養層細胞對囊胚種植更重要。Bakkensen 等[7]報道滋養細胞層的質量與臨床妊娠率和活產率相關。但亦有研究發現，內細胞團評分越高，其囊胚的整倍體率也越高[11]。在新鮮移植周期內細胞團評分與活產率呈正相關關系[6]。

表4 優質囊胚組和非優質囊胚組的妊娠結局比較[n/n（%）]

3.3 優質囊胚與非優質囊胚移植的妊娠結局比較

本研究將復蘇周期中單個四期囊胚移植分為兩組：優質囊胚和非優質囊胚，發現囊胚的總體質量可預測患者的妊娠結局。優質的四期囊胚有更高的臨床妊娠率、更低的生化妊娠率和早期流產率。現有的文獻報道均支持相同的觀點，即囊胚整體質量顯著影響臨床妊娠率和活產率[12-14]。內細胞團和滋養層細胞達到A 或B 級的囊胚和其中之一為C 級的囊胚移植后相比，臨床妊娠率和活產率有顯著性提高[15-16]。

3.4 本研究的局限性

本研究仍存在一定的缺陷。首先，所納入的復蘇周期的單囊胚移植周期數量較少，仍需要繼續擴大樣本量進行深入分析；此外，后續研究需要細分囊胚的發育天數對妊娠結局的影響。

綜上所述，囊胚形態學評分是復蘇周期中具有顯著意義的評價臨床妊娠率的預測指標。對于非優質囊胚而言，滋養細胞層對囊胚種植潛能具有更重要的臨床意義，可作為預測臨床妊娠率的正性相關指標。本研究為復蘇周期中單囊胚移植在形態學評分相似的情況下提供了選擇依據。