礦泉水中產氣莢膜梭菌檢測能力驗證經驗

摘 要：產氣莢膜梭菌（C.perfringens）又稱魏氏梭菌，厭氧芽孢桿菌屬。廣泛存在自然界的水源、土壤及人和動物腸道中。它是條件致病菌，主要引起人的食物中毒、氣性壞疽和動物猝死癥等疾病。產氣莢膜梭菌的重點檢測項目是活菌數的測定和證實試驗。GB 8538-2016飲用天然礦泉水中產氣莢膜的檢測標準中說明，產氣莢膜梭菌在SPS平板上36 ℃下厭氧培養24 h，菌落形態為黑色。但在實際檢驗中SPS平板上的菌落形態難以呈黑色，如果改用TSC平板可以長出較多黑色菌落。TSC培養基中檸檬酸鐵銨和亞硫酸鈉的含量比SPS要高，實驗證明TSC培養基要比SPS培養基更能長出黑色菌落。

關鍵詞：礦泉水;產氣莢膜梭菌;檢測方法

1 礦泉水中產氣莢膜梭菌能力驗證遇到的問題和解決方法

2019年9月份參加礦泉水中產氣莢膜梭菌能力驗證中遇到的問題：濾膜無黑色菌落產生，只有少量灰色和大量白色雜菌生長。由于大量雜菌存在，導致確證試驗中生化現象不明顯，最終實驗結果沒有通過。

2019年12月份再次參加產氣莢膜梭菌測量審核，綜合研究GB 4789.13-2012 和GB 8538-2016及各方資料[1-2]，制定以下實驗方案。

按照測量審核作業指導書，先把凍干粉水化得到的原液，然后進行10倍和100倍稀釋，得到稀釋液，對原液、稀釋液進行檢測。

方法1，取50 mL樣液用0.45 μm濾膜抽濾，然后將濾膜正貼在SPS平板上，抽濾，做1個平板。

方法2，取50 mL樣液用0.22 μm濾膜抽濾，然后將濾膜正貼在SPS平板上，抽濾，共2個平板。

方法3，取50 mL樣液用0.22 μm濾膜抽濾，然后將濾膜正貼在SPS平板上，再覆蓋一層SPS培養基，抽濾，做1個平板。

方法4，取50 mL樣液用0.22 μm膜抽濾，然后將濾膜反貼在SPS平板上，即抽濾面朝下，抽濾，做1個平板。

方法5，取50mL樣液用0.22μm膜抽濾，然后將濾膜正貼在TSC平板上，抽濾，做1個平板。

同時做陰陽性對照，將以上平板在（36±1）℃下厭氧培養24 h，結果如表1所示。

驗證試驗，挑取各種形態不同的菌落做生化檢驗，驗證試驗結果：

所有菌落都可以在FTG旺盛生長;透明白色的菌落生化指標都不符合;灰色和黑色菌落中有部分菌的生化指標全部符合，也有部分菌的生化指標部分符合，可能是雜菌太多，挑取菌落時帶有雜菌。

結果報告：參考實驗中方法2的灰色菌落（136、146灰）和方法5的黑色菌落數（173黑）的數據，報了140 CFU/50 mL，通過了驗證。

2 結果分析

從方法1和方法5對比看，用TSC平板貼濾膜更容易長出黑色菌落，更容易識別目標菌。這是因為TSC培養基中檸檬酸鐵銨和亞硫酸鈉的含量比SPS高，產氣莢膜梭菌可以還原亞硫酸鹽為硫醚，硫醚可以與檸檬酸鐵銨反應呈黑色。增加亞硫酸鹽的量和檸檬酸鐵銨的量，可以增強黑色[3]。

方法5中黑色菌落在空氣中暴露一段時間，顏色變淺，是因為產氣莢膜梭菌能將亞硫酸鹽還原為硫化物，在含亞硫酸鹽和鐵鹽的瓊脂中形成黑色菌落，遇空氣后被氧化，黑色漸漸變成灰色，所以培養后要盡快計數和驗證。

從10倍稀釋液的結果看，方法1的結果是16個灰色菌落，方法2平均為18灰色菌落，結果相差不大，因此，0.45 μm的濾膜和022 μm的濾膜都可以用。

方法3和方法4中，覆蓋一層SPS培養基和濾膜反貼也能長出黑色菌落。覆蓋一層長出菌落較少，反貼濾膜不利于后續挑取菌落。

SPS和TSC上都易有較多雜菌生長（TSC相對少點），且FTG是非選擇性增菌肉湯。所以，雜菌較多時，可先把可疑菌分離純化到TSC平板上，再將單菌落接到FTG中，最后進行生化試驗。

參考文獻

[1]中華人民共和國衛生部.GB 4789.13-2012 食品安全國家標準食品微生物學檢驗產氣莢膜梭菌檢驗[S].北京：中國標準出版社，2012.

[2]中華人民共和國國家衛生和計劃生育委員會.GB 8538-2016 食品安全國家標準 飲用天然礦泉水檢驗方法[S].北京：中國標準出版社，2016.

[3]潘寶怡，吳清平，彭飛艇，等.飲用天然礦泉水中產氣莢膜梭菌檢測國標方法的改進[J].現代食品科技，2012（9）：1236-1238.

作者簡介：徐萬麗（1983—），女，廣東梅州人，大專，質量工程師。研究方向：食品檢測。