miR-19a對腹主動脈瘤血管平滑肌細胞增殖遷移及炎癥浸潤的影響

歐陽勇，劉彥，葉洋波

（杭州市富陽區第一人民醫院 血管外科，浙江 杭州 311400）

腹主動脈瘤（abdominal aortic aneurysm，AAA）是常見的慢性主動脈退行性疾病，具有高發病率和高病死率，嚴重危害中老年人生命健康。臨床研究發現，主動脈血管平滑肌細胞（vascular smooth muscle cells，VSMCs）異常增殖、巨噬細胞浸潤和基質降解與AAA的發生發展密切相關[1]。但是，有關AAA發展過程中的炎癥浸潤和VSMCs增殖和凋亡的調控機制尚未完全闡明。近年研究發現微小RNA（miRNA）在AAA組織中異常表達，且與其發生發展密切相關[2-3]。已有研究表明，過表達miRlet-7a可下調炎癥反應[4]，過表達miR-21可抑制VSMCs增殖和誘導細胞凋亡，促進AAA的發展[5]。此外，LIU等[6]研究發現，miR-19a在AAA組織中高表達，但其在AAA的發生發展進程中的作用機制尚不清楚。本研究通過檢測miR-19a在AAA患者AAA組織和血清中的表達水平，探討miR-19a對主動脈VSMCs生物學行為以及炎癥浸潤的影響和作用機制，以期為AAA臨床治療提供潛在靶點和實驗依據。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 收集臨床樣本：組織標本為2015年3月至2017年6月于杭州市富陽區第一人民醫院經手術切除的15例AAA患者的腹主動脈組織和器官移植中心行肝臟、腎臟器官移植術（供體排除AAA以及其他腹主動脈相關病變）15例患者殘留的部分正常腹主動脈組織。血清樣本來源于15例AAA患者和同期進行體檢的15例健康者。手術前均告知患者并簽署知情同意書，并獲得本院倫理委員會批準。

1.1.2 細胞和主要試劑：人主動脈VSMCs（BNCC340185）和人單核巨噬細胞THP-1（BNCC100407）均購自廣州北納生物科技有限公司；細胞培養基RPMI-1640購自美國Thermo Fisher公司；細胞培養基DMEM/F12和α-MEM、胰蛋白酶和胎牛血清均購于美國Gibco公司；miR-19a inhibitor/mimic，pcDNA3.1-CDKN2B質粒以及陰性對照均由上海吉馬公司合成；TRIzol試劑盒購自美國Invitrogen公司；LipofectamineTM3000和反轉錄試劑盒購自日本TaKaRa公司；Transwell小室購自美國康寧公司；ELISA試劑盒購于美國Sigma Aldrich公司；兔抗人細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑2B（cyclin dependent kinase inhibitor 2B，CDKN2B）、β-actin單克隆抗體和HRP山羊抗鼠IgG均購自美國Cell Signaling Technology公司；青霉素、鏈霉素、BCA蛋白定量試劑盒、CCK-8試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司；雙熒光素酶報告基因試劑盒購自美國Promega公司。

1.2 方法

1.2.1 巨噬細胞分離和培養：采用淋巴細胞分離培養基從AAA患者和健康體檢者外周血中分離單個核細胞。采用PBS緩沖液按照1:1的比例稀釋肝素化的血清，2000 r/min離心20 min，收集乳白上清液，再加入4 mL細胞洗滌液于2000 r/min離心20 min即可得到外周血單個核細胞。隨后，將分離得到的外周血單核細胞懸液置于含有10%的胎牛血清、雙抗（100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素）、25 ng/mL單核細胞集落刺激因子的α-MEM培養基中培養。

1.2.2 細胞培養和轉染：采用含有10%的胎牛血清和雙抗的DMEM/F12培養VSMCs和采用RPMI-1640培養THP-1細胞，置于37 ℃、5% CO2的培養箱中培養。待細胞生長密度達到80%時，以2×105個/孔的濃度接種到6孔板中，置于培養箱中培養。鋪板24 h內，培養至細胞單層密度達到50%～60%時進行轉染。將VSMCs或THP-1細胞分別轉染miR-19a inhibitor、miR-19a mimic和pcDNA3.1-CDKN2B。轉染后放入培養箱培養8 h，更換雙倍血清的培養基，繼續培養48 h，收集細胞用于后續實驗。

1.2.3 RT-qPCR檢測miR-19a的表達水平：收集組織、血清樣本和處理后的細胞，采用TRIzol提取細胞中總RNA，并采用NanoDrop檢測RNA的濃度。隨后，采用一步法反轉錄試劑盒將RNA反轉錄為cDNA，嚴格按照qPCR試劑盒說明書檢測miR-19a表達水平，以U6為內參。miR-19a上游引物為5’-CTGGAGTGTGCAAATCTA TGC-3’，下游引物為5’-GTGCAGGGTCCGAGGT-3’；U6上游引物為5’-CTCGCTTCGGCAGCACATATACT-3’，下游引物為5’-ACGCTTCACGAATTTGCGTGTC-3’。實驗重復3次。

1.2.4 Western blot檢測蛋白的表達水平：收集處于對數期的VSMCs和THP-1細胞，采用RAPI裂解液提取細胞中的總蛋白，檢測蛋白質濃度。進行10% SDS-PAGE分離蛋白、電轉膜法將目的條帶轉移至PVDF膜上，以5%脫脂奶粉室溫封閉1 h后分別加入CDKN2B（1:1000）和β-actin抗體（1:1000），4 ℃孵育過夜。之后，加入HRP標記的山羊抗鼠IgG（1:2000）室溫孵育2 h。最后，進行ECL染色，凝膠成像儀采集圖像；通過ImageJ分析灰度值。實驗重復3次。

1.2.5 CCK-8檢測VSMCs細胞增殖活力：將經轉染和未轉染處理的VSMCs細胞培養至處于對數生長期后，以2×104個/孔的濃度接種于96孔板中，并在每孔中加入100 μL DMEM培養基（含有50%巨噬細胞培養上清），每組設6個復孔。置于37 ℃、5% CO2的培養箱中培養0、24、48、72和96 h后，向每孔中加入10 μL CCK-8溶液（0.5 mg/mL）后繼續于培養箱中孵育4 h后，采用酶標儀檢測450 nm處的每孔光密度（OD450）值。

1.2.6 Transwell檢測VSMCs細胞遷移能力：將經轉染和未轉染處理的VSMCs細胞培養至處于對數生長期后，以1×105個/孔的濃度接種于Transwell小室上室，下室加入500 μL混合培養基（250 μL巨噬細胞培養上清液和250 μL DMEM/F12培養基）后常規培養24 h。采用0.1%結晶紫染色20 min，并于光學顯微鏡下隨機選擇5個視野計算侵襲和遷移細胞數。實驗重復3次。

1.2.7 流式細胞術檢測VSMCs凋亡情況：取各組細胞以1×105個/孔接種于96孔板中，過夜培養后用胰蛋白酶消化細胞，PBS洗滌后加入300 μL結合液重懸，加入10 μL Annexin V-FITC室溫避光孵育15 min，再加入5 μL PI溶液染色，混合均勻后避光孵育5 min，流式細胞儀檢測細胞凋亡百分比。

1.2.8 雙熒光素酶報告基因驗證miR-19a和CDKN2B的靶向關系：由湖南普拉特澤生物科技有限公司構建CDKN2B基因的3’UTR，插入pGL3-Promoter質粒載體中，將該重組質粒命名為pGL3-CDKN2B-3’UTR WT，采用基因突變法定點突變獲得CDKN2B突變型載體（pGL3-CDKN2B-3’UTR MUT）。然后，將HEK 293T細胞接種于12孔板中，待細胞匯合度達到50%～70%時分別將miR-19a mimic和mimic-NC，CDKN2B野生型載體、CDKN2B突變型載體共轉染于HEK 293T細胞中，轉染6 h后更換為新鮮的含10%胎牛血清的DMEM培養液，繼續培養36 h。最后，采用雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒檢測熒光素酶活。實驗重復3次。

1.2.9 ELISA檢測炎性因子的表達水平：將經轉染和未轉染處理的THP-1細胞培養于含有50%巨噬細胞培養上清液RPMI-1640培養基中，培養結束后嚴格按照ELISA試劑盒說明書檢測TL-1β、TNF-α和IL-6的表達水平。

1.3 統計學處理方法 采用SPSS22.0對所有數據進行統計學分析。計量資料以±s表示，2組比較采用t檢驗，多組比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 miR-19a在AAA組織和血清中高表達 RT-qPCR檢測結果顯示，miR-19a在AAA組織中的表達水平明顯高于正常腹主動脈組織（P＜0.01）。與健康組比，miR-19a在AAA患者血清中的表達水平明顯上調（P＜0.01）。見圖1。

圖1 miR-19a在AAA患者組織（A）和血清（B）中的表達

2.2 敲降miR-19a可顯著抑制VSMCs增殖、遷移和誘導細胞凋亡 RT-qPCR檢測結果顯示，相比于對照組，敲降miR-19a可明顯下調miR-19a在VSMCs中的表達水平（P＜0.01），見圖2A；CCK-8檢測結果顯示，敲降miR-19a后VSMCs增殖活力明顯低于對照組（P＜0.01），見圖2B；流式細胞術檢測結果顯示，相比于對照組，敲降miR-19a可顯著誘導VSMCs凋亡水平（P＜0.01），見圖2C；Transwell檢測結果顯示，敲降miR-19a可顯著抑制VSMCs遷移能力（P＜0.01），見圖2D。

2.3 敲降miR-19a抑制THP-1細胞炎癥因子和基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMPs）的表達 ELISA檢測結果顯示，相比于對照組，敲降miR-19a可明顯抑制THP-1細胞中炎癥因子（TNF-α、IL-6和IL-1β）的表達水平（P＜0.01），見圖3A-C。Western blot檢測結果表明，敲降miR-19a可明顯抑制單核細胞趨化蛋白-1（monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1）、MMP-2和MMP-9的表達水平（P＜0.01），見圖3D。由此可知，敲降miR-19a可明顯抑制THP-1細胞中炎癥因子和THP-1細胞表面蛋白的表達水平。

圖2 敲降miR-19a對VSMCs增殖、凋亡和遷移（×100）的影響

2.4 miR-19a靶向負調CDKN2B的表達 通過比對TargetScan數據庫發現，CDKN2B是miR-19a的潛在靶基因，其結合位點如圖4A所示。同時，雙熒光素酶報告基因結果表明，相比于對照組（mimic-NC），過表達miR-19a可顯著減少野生型CDKN2B質粒的熒光素酶活性（P＜0.01），但對突變型CDKN2B質粒熒光素酶的活性沒有影響，見圖4B。Western blot檢測結果發現，過表達miR-19a可顯著下調VSMCs中CDKN2B蛋白的表達水平（P＜0.01），見圖4C。

2.5 miR-19a靶向CDKN2B抑制VSMCs增殖、侵襲和誘導凋亡 Western blot檢測結果表明，與對照組比，過表達CDKN2B可顯著上調VSMCs中CDKN2B蛋白的表達水平（P＜0.01），但同時過表達miR-19a和CDKN2B后VSMCs中CDKN2B的表達水平與對照組差異無統計學意義（P＞0.05），見圖5A。CCK-8檢測結果顯示，過表達CDKN2B可顯著抑制VSMCs增殖活力（P＜0.01），見圖5B。流式細胞術檢測結果表明，與對照組比，過表達CDKN2B可顯著誘導VSMCs凋亡水平（P＜0.01），見圖5C。Transwell檢測結果顯示，過表達CDKN2B后VSMCs遷移能力明顯低于對照組（P＜0.01），見圖5D。但同時過表達miR-19a和CDKN2B后可明顯緩解僅過表達CDKN2B對VSMCs增殖、凋亡和遷移的調控作用（P＜0.01），見圖5B-D。

圖3 敲降miR-19a對THP-1細胞炎癥因子和MMP表達的影響

2.6 miR-19a靶向CDKN2B下調THP-1細胞炎癥因子和MMPs的表達水平 ELISA檢測結果顯示，相比于對照組，過表達CDKN2B可顯著下調TNF-α、IL-6和IL-1β的表達水平（P＜0.01），但同時過表達miR-19a和CDKN2B可緩解僅過表達CDKN2B對炎癥因子的抑制作用（P＜0.01），見圖6。Western blot檢測證實，相比于對照組，過表達CDKN2B可顯著抑制MCP-1、MMP-2和MMP-9蛋白的表達水平（P＜0.01）；但同時過表達CDKN2B和miR-19a后MCP-1、MMP-2及MMP-9蛋白的表達水平與對照組比差異無統計學意義。見圖5A。

3 討論

AAA是一種嚴重的遲發性血管疾病，病死率高。近年來，miRNA被廣泛報道通過調控細胞生物學行為，進而參與多種疾病的發生發展進程。LI等[7]研究表明，miR-19a可作為心臟、血管和神經元相關疾病的早期診斷和治療靶點。MENG等[8]研究發現，miR-183和miR-141與AAA的不良預后密切相關。過表達miR-155-3p通過促進VSMCs的增殖和抑制細胞凋亡，進而促進AAA的發生與發展[9]。PENG等[10]研究表明，過表達miR-26a通過靶向PTEN促進VSMCs增殖和誘導細胞凋亡，進而誘導AAA的發展。同時，前期研究也證實，異常表達的miR-19a與炎癥和腫瘤密切相關[11-12]。本研究結果表明，與對照組相比，miR-19a在AAA主動脈壁組織和血清中高表達；敲降miR-19a可顯著抑制VSMCs增殖和遷移能力，以及誘導細胞凋亡；同時，敲降miR-19a抑制了THP-1細胞因子和MMPs的表達。機制上，miR-19a通過靶向下調CDKN2B的表達，進而促進VSMCs增殖和轉移，誘導炎癥反應和MMPs的表達，從而加速AAA的發展進程。

圖5 miR-19a靶向CDKN2B對VSMCs增殖、凋亡和細胞遷移（×100）的影響

圖6 miR-19a靶向CDKN2B對THP-1細胞炎癥因子表達水平的影響

巨噬細胞是炎癥和免疫學的關鍵細胞之一，miR-19a在多種炎癥遞質作用下表達增強[13-14]。巨噬細胞的存在可損傷動脈壁，因為巨噬細胞產生的MMPs可以降解血管管壁中層彈力纖維，造成血管壁順應性降低，并在血流的沖擊作用下加劇瘤體擴張，使膠原蛋白產生崩解[15]。例如，敲降miR-33-5p可通過緩解THP-1炎癥因子的表達和MMPs的表達，進而緩解AAA的發展進程[16]。同時，ZHANG等[17]研究結果證實，敲降miR-155通過抑制THP-1細胞炎癥反應和MMPs的表達，進而緩解血管緊張素II誘導小鼠AAA形成。miR-195通過抑制炎性因子和MMPs的表達，緩解了AAA的發展進程[18]。與前期研究一致，本研究發現miR-19a水平在AAA患者組織和血清中高表達。同時，敲降miR-19a抑制了THP-1細胞上清液中炎癥因子的表達水平以及主動脈彈性蛋白的表達。此外，過表達miR-19a促進了VSMCs的遷移。以上研究結果提示，抑制炎癥反應和MMPs的表達可預防AAA動脈壁破裂的發生。

CDKN2B作為多種惡性腫瘤的抑癌基因，通過介導細胞增殖、周期和凋亡進而抑制腫瘤的發展進程[19-20]。在血管系統中，CDKN2B通過介導p53參與血管重塑[21]。LEEPER等[22]研究表明，敲降CDKN2B通過上調p53的表達，進而促進動脈瘤的形成。GAO等[23]研究發現，過表達miR-15a通過靶向抑制CDKN2B上調平滑肌細胞增殖和抑制細胞凋亡，從而促進AAA的發展進程。同時，本研究結果同樣證實，敲降miR-19a通過靶向上調CDKN2B抑制平滑肌細胞增殖和誘導細胞凋亡，以及緩解THP-1細胞上清炎癥因子和MMPs的表達，進而緩解AAA的發展進程。由以上實驗結果和文獻資料我們推斷，miR-19a/CDKN2B分子軸在AAA的發生發展中發揮重要作用，并且調控VSMCs增殖、凋亡和細胞遷移以及炎性細胞浸潤，但其能否作為新的治療靶點投入到臨床中還需要進一步深入研究。