微生物發酵制備煙用酸角浸膏的研究

吳明美 李仙 鄭琳 蔣美紅

摘要：對酸角浸膏進行微生物發酵，應用SPSS軟件對發酵工藝進行優化。卷煙加料試驗表明，經過微生物處理后，在保留原有酸角浸膏柔和細膩香氣的功能外，還能增加特殊的發酵香氣，增加甜潤感，降低刺激，對煙香的改善更加明顯;發酵后的酸角浸膏揮發性成分種類和含量增加。

關鍵詞：微生物發酵;酸角浸膏;卷煙加料;化學成分

中圖分類號：TQ657+.4?文獻標識碼：A

文章編號：0439-8114（2020）07-0180-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2020.07.036

Abstract： The extract of Tamarindus indica L. was carried out by method of microbial fermentation，and the fermentation process was optimized with SPSS Software. The fermentative extract was applied in cigarette as a flavor. The research result showed that after microorganism treatment，the special fermentation aroma was increased. Besides soft and delicate aroma，the sweetness was increased，the stimulation was reduced，and the improvement of tobacco aroma was more obvious. The species and content of volatile components increased.

Key words：microbial fermentation; the extract of Tamarindus indica L.; cigarette casing; volatile composition

酸角（Tamarindus indica L.），又稱酸豆、羅望子，為蘇木科（Caesalpiniaceae）酸豆屬（Tamarindus）的一種常綠大型喬木，為單屬單種植物[1]。酸角花、葉、果均可食用，成熟果肉、幼葉和花中均富含鈣、磷、鐵、維生素A、硫胺素、核黃素、煙酸和抗壞血酸[2]，其中以果肉營養價值較高[3-5]，含有豐富的還原糖、有機酸、氨基酸及各種礦物質[6，7]，常被加工成酸角飲料、果露等，在食品、保健品行業得到廣泛應用[8-10]。在煙草行業中，酸角浸膏是較為常用的香精原料，一般采用單一溶劑進行萃取和濃縮得到;也有用超臨界CO2流體萃取酸角揮發油用于卷煙加香，以及提取酸角種子多糖用于再造煙葉粘合劑的報道。根據文獻報道，酸角果實中，糠醛、苯乙醛和5-甲基糠醛等芳香成分能夠明顯增加煙香，有機酸能夠降低刺激和改善口感，還原糖具有柔和煙氣等作用[11，12]，但其果實中也含有蛋白質、果膠等對感官不利的成分。為實現酸角在煙草中的最佳利用，本研究對酸角浸膏進行微生物發酵處理，得到一種酸角發酵香料。

微生物制備的香料是以天然原料為起始物，使用發酵技術、酶技術產生的香料也屬于天然香料，且其具有生產周期短、不受氣候影響、反應條件溫和、產品分離后形成的“三廢”少、對環境友好等多種優點[13]。有文獻報道，經過發酵處理后的提取物，能明顯改善卷煙的抽吸品質[14-16]。本研究采用微生物發酵技術對酸角浸膏進行處理，對處理前后的酸角浸膏進行卷煙加料試驗，并進行化學成分分析。

1?材料與方法

1.1?儀器與材料

儀器：HP6890/5973型GC/MS分析儀（美國Agilent公司）、恒溫培養箱（湖北黃石市醫療器械廠）、電子天平（瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司）。

材料：酸角浸膏由云南瑞升煙草技術（集團）有限公司制備，菌株為實驗室保存的菌株V3，紫云成品煙購買于超市。

1.2?種子液

接種子液時培養基∶甘油保存菌液=1 000∶1，接種后于37 ℃、185 r/min條件下培養16 h。用紫外分光光度計檢測OD值[17，18]，用空白LB培養基做對照，在600 nm測種子液吸光值，OD=1.5～3.0。

1.3?酸角浸膏發酵處理

稱取100 g酸角浸膏，加入300 g水，在121 ℃下高壓滅菌20 min，放至常溫后，在無菌條件下按酸角浸膏∶種子液=1 000∶1（質量比）接入菌液。接種好的酸角浸膏放入搖床中，37 ℃、180 r/min條件下發酵24 h。將發酵好的酸角浸膏過濾后濃縮成相對密度為1.373±0.008，即得酸角浸膏。

1.4?酸角浸膏的揮發性成分分析

同時蒸餾萃取：取煙葉粉末25 g放入蒸餾萃取裝置一端的500 mL圓底燒瓶中，加入250 g水，用電熱套加熱，裝置的另一端為盛25 mL二氯甲烷的100 mL圓底燒瓶，用60 ℃水浴加熱，同時蒸餾萃取2 h。二氯甲烷萃取液用無水硫酸鈉干燥，置于4 ℃保藏柜放置，過濾，濾液倒入濃縮瓶中用Vigreux柱濃縮至約1 mL，濃縮液用于GC/MS分析備用。

GC/MS條件：毛細管柱HP-5MS（30 000 mm×0.25 mm×0.000 25 mm）;進樣口溫度240 ℃;載氣He，1 mL/min;程序升溫50 ℃（1 min）→8 ℃/min→160 ℃（2 min）→8 ℃/min→260 ℃（15 min）;進樣量1 μL，分流比20∶1;傳輸線溫度280 ℃;電離方式EI，電離能量70 eV;離子源溫度230 ℃;四級桿溫度160 ℃;質量范圍35～455 aum，溶劑延遲時間2 min。

1.5?酸角浸膏在卷煙中的加料試驗

取22 ℃、60%相對濕度條件下平衡48 h后的空白煙絲若干份40 g份，分別稱取0.01、0.02、0.04 g發酵酸角浸膏（相對于煙絲用量分別為0.025%，0.050%，0.100%），用猴頭噴霧器均勻地添加到煙絲中，然后在22 ℃、60%相對濕度條件下平衡48 h，請評吸小組進行評吸。對照為添加相同質量蒸餾水的煙絲制備的卷煙。

2?結果與分析

2.1?工藝優化

以發酵工藝中的3個關鍵單因素即發酵時間、初始浸膏稀釋倍數、接種量為單因素考察對象，以抽吸分數作為考察指標，采用SPSS[14-16]軟件中的正交試驗設計對發酵工藝進行優化。

2.1.1?正交試驗結果的直觀分析?表2結果表明，根據極差值R的大小，各因素對發酵酸角浸膏的感官評吸程度的影響排序為發酵時間（C）>接種量（B）>浸膏稀釋倍數（A）。根據平均評吸分數K的大小，可以看出稀釋倍數、接種量和發酵時間分別為A2、B3和C3時，評吸分數最高。因此可以確定最佳工藝為A2B3C3，即稀釋倍數為3倍，接種量為0.15%，發酵時間為36 h。

2.1.2?正交試驗結果的方差分析和多重比較?方差分析結果表明，A、B、C均影響極顯著（P<0.01）。由表2和表3可知，方差和極差的分析結果一致。多重比較結果表明，A1和A3之間差異不顯著（P>0.05），其余水平之間差異極顯著（P<0.01）。B各水平之間差異顯著（P<0.05），C各水平之間差異極顯著（P<0.01）。因此可以確定最佳工藝為A2B3C3，即稀釋倍數為3倍，接種量為0.15%，發酵時間36 h。按照最佳工藝的提取條件進行試驗驗證，最后的評吸分數為87.68，試驗驗證準確。

2.2?發酵酸角浸膏的感官評價結果

由表7可知，普通酸角浸膏在卷煙中具有柔和細膩香氣，增加煙香，改善刺激和余味的作用，添加量在0.05%左右較合適。經過微生物處理后，在保留酸角特有的功能基礎上，還能增加特殊的發酵香氣，增加甜潤感，降低刺激，對煙香的改善更加明顯。

2.3?揮發性成分分析

對兩種酸角浸膏進行揮發性成分檢測，其檢測結果見圖1、圖2和表8。兩種浸膏在揮發性成分上有一定的差別，未發酵浸膏共鑒定出37種化學成分，發酵浸膏中鑒定出46種化學成分。其中，對煙草有正面效果的醛類致香成分如糠醛、5-甲基糠醛[19，20]等經發酵后含量顯著提高。

3?結論

通過微生物發酵手段取得的酸角浸膏，在保留酸角特有的功能外，還能增加特殊的發酵香氣，增加甜潤感，降低刺激，對煙香的改善更加明顯。致香成分分析表明，經過微生物發酵后，揮發性成分的種類和含量明顯增加，其中糠醛、5-甲基糠醛等煙草中的致香成分增加明顯。

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