饑餓誘導三陰性乳腺癌細胞株MDA-MB-231的自噬應答觀察

劉宇坤，胡楊，卯升義，許安永，鄒迪，熊喆，成文敏，趙紅業1,

1 大理大學藥學與化學學院，大理 671000；2 云南省動物基因編輯與體細胞克隆技術重點實驗室；3云南農業大學植物保護學院；4云南農業大學動物科學技術學院；5 云南省異種器官移植工程研究中心

乳腺癌是一種復雜的異質性疾病，根據激素狀態可分為激素受體陽性、人類表皮生長因子2(HER-2)陽性和三陰性等不同亞型[1]。2019年美國乳腺癌新診斷病例數占全部新診斷腫瘤病例數的30%[2]。我國每年新發乳腺癌患者約30.4萬例，其中發展中地區發病率略高于發達地區。他莫昔芬、依西美坦等抗腫瘤藥物可通過干擾激素的合成治療激素受體陽性型乳腺癌，曲妥株單抗可用于治療HER-2陽性型乳腺癌[3]。三陰性乳腺癌患者無法進行靶向治療，主要治療方法為化療，但化療易導致腫瘤細胞耐受，達不到理想的治療效果[4]，且化療后患者復發概率較大。研究[5]認為，具有耐藥性的休眠癌細胞發生了傳播是三陰性乳腺癌復發的原因之一，這種特殊的耐藥機制可能源于自噬對細胞的保護機制。自噬(autophagy)是真核細胞中一種高度保守的細胞生物學行為，是細胞自體的吞噬、消化過程，可為細胞提供營養物質和能量，維持細胞的代謝平衡，緩解應激壓力[6]。當遇到不利環境，如營養缺乏、代謝受阻、輻射、抗癌藥物等外界因素刺激時，細胞會發生自噬，作為一個暫時的生存機制[7]。LC3B的增加是自噬的重要標志。自噬相關基因(autophagy related gene, ATG)的表達是形成自噬體的關鍵因素，參與調控自噬過程。自噬調控機制的失調與惡性腫瘤、自身免疫疾病等多種疾病的發生發展有關。自噬抑制劑巴弗洛霉素通過抑制自噬基因ATG5、BECN1、ATG10的激活，提高天然抗癌化合物對人鱗癌、膠質母瘤細胞的毒性[8]。ATG7表達被降低后，腫瘤微環境形成受到抑制[9,10]，ATG4B拮抗劑可抑制骨肉瘤腫瘤的形成[11]。Beclin1缺失的小鼠更容易患淋巴瘤、肺癌和卵巢癌等上皮細胞及造血系統類腫瘤[12,13]，表明癌細胞中自噬水平的高低在惡性腫瘤的發生、逃避和抵抗中發揮重要作用。因此，了解自噬相關基因對自噬的調控作用，開發控制自噬的特異性藥物，將有利于解決三陰性乳腺癌的耐藥性問題。

我們觀察了饑餓條件下三陰性乳腺癌細胞株MDA-MB-231的自噬應答水平，檢測自噬相關基因ATG4A和ATG7，并探討其相關分子機制，旨在為臨床上三陰性乳腺癌的靶向治療提供新治療靶點。

1 材料與方法

1.1 細胞、試劑及儀器 人三陰性乳腺癌細胞株MDA-MB-231購于上海中科院細胞庫；DMEM培養基、Earle′s平衡鹽溶液(EBSS)購于美國Gibco公司，巴弗洛霉素A1(Bafilomycin A1)購于上海生工生物工程有限公司；雙抗(青霉素-鏈霉素)購于Biological industries；胎牛血清購于ExCell Bio公司；微管相關蛋白輕鏈1(LC3B)、β-actin、自噬相關蛋白7(ATG7)一抗購于美國Sigma公司；自噬相關蛋白4A(ATG4A)一抗購于美國圣克魯司公司；Trizol 購于賽默飛世爾公司；Prime-Script RT試劑盒、SYBR酶購于美國Takara公司；BCA蛋白濃度檢測試劑盒、發光顯色液、蛋白提取試劑(RiPA Lysis Buffer)、蛋白 Marker和Western一抗稀釋液均購于碧云天生物科技有限公司；血清白蛋白購于北京索萊寶有限公司。

1.2 細胞饑餓處理及分組 取MDA-MB-231細胞，接種于涂有明膠的75 cm2細胞瓶中，培養于10 mL 含10%熱滅活胎牛血清、100 IU/mL青霉素的DMEM培養基中，置于37 ℃、5% CO2的培養箱中培養。12 h換液一次，待細胞長至培養瓶80%左右進行細胞傳代，取對數生長期的細胞分別接種于10 cm2細胞培養皿和六孔板。細胞密度長至70%左右，將細胞分為四組，對照組加入DMEM培養液正常培養，Baf-A1組在DMEM培養液中加入100 nM的Baf-A1，EBSS(饑餓)組加入EBSS培養液，EBSS+ Baf-A1(自噬阻斷)組在EBSS培養液中加入100 nM的Baf-A1，四組均處理8 h，備用。

1.3 各組細胞LC3B、ATG4A、ATG7 mRNA檢測 采用實時熒光定量法(Q-PCR)法。取各組細胞，Trizol提取總RNA，cDNA使用Prime-Script RT試劑盒合成。獲得的cDNA作為SYBR Greenbased q-PCR的模板(CFX-96,Bio-Rad, Hercules, CA, USA)，定量聚合酶鏈反應檢測各組LC3B、 ATG4A、ATG7 mRNA。引物序列由深圳華大基因有限公司合成，甘油-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)為內參，基因序列見文獻[14]。以2-ΔΔCT值代表目的基因相對表達量，重復3次取平均值。

1.4 各組細胞LC3B、ATG4A、ATG7蛋白檢測 采用Western blotting法。取各組細胞PBS洗滌2次，收集細胞，加入等體積通用蛋白裂解液(內含1 μM的蛋白酶抑制劑)，4 ℃裂解15 min。4 ℃，13 500 rpm/min離心7 min提取細胞總蛋白，BCA蛋白檢測試劑盒測定總蛋白濃度。變性后，取30 μg總蛋白上樣，12%凝膠電泳分離后轉移至聚偏二氟乙烯膜，放入5%血清白蛋白(BSA)中，常溫封閉2 h，阻止非特異性結合。加入一抗LC3B、ATG4A、ATG7、β-actin(工作濃度：1∶2 000、1∶1 000、1∶1 000、1∶5 000)，4 ℃孵育過夜。磷酸緩沖鹽溶液(PBST)洗膜，10 min×3次，加入配好的二抗(兔抗或鼠抗)，室溫下搖床孵育2 h，PBST洗滌10 min×3次，化學發光ECL(Easysee Western Blotting Kit, Transgenes，中國)孵育1 min后成像系統(Bio-Rad, Hercules，美國)進行顯影，以β-actin為內參，檢測LC3B、ATG4A和ATG7蛋白的相對表達量，重復3次，取平均值。

2 結果

2.1 各組細胞LC3B、ATG7、ATG4A mRNA相對表達量比較 各組細胞LC3B、ATG7、ATG4A mRNA相對表達量比較見表1。

表1 各組細胞LC3B、ATG7、ATG4A mRNA相對 表達量比較

2.2 各組細胞LC3B、ATG7、ATG4A 蛋白相對表達量比較 各組細胞LC3B、ATG7、ATG4A蛋白相對表達量見表2。

表2 各組細胞LC3B、ATG7、ATG4A 蛋白相對表達量 比較

3 討論

自噬是一種在應激狀態下維持細胞內外穩態的分解代謝途徑，自噬在營養剝奪或其他類型的應激條件下易被誘導，在此過程中LC3B通過幾種ATG蛋白與脂質磷脂酰乙醇胺結合，隨后作為脂化的LC3BⅡ整合到自噬體膜中，因此LC3BⅡ的積累是反應自噬水平的重要標志。本研究中，EBSS組細胞LC3B mRNA的相對表達量和LC3BⅡ/LC3BⅠ均升高，表明EBSS可提高MDA-MB-231細胞的自噬水平。細胞LC3BⅡ/LC3BⅠ上升除了自噬通量增加，還可能是因為自噬體降解失敗[15]。為了區分這兩種情況，必須進行溶酶體降解被阻斷的自噬通量實驗，Baf-A1是自噬溶酶體抑制劑，可完全抑制溶酶體酸化，阻止自噬泡與溶酶體結合，達到阻斷自噬的作用[16]。本研究中，使用Baf-A1處理MDA-MB-231細胞，LC3BⅡ/LC3BⅠ在EBSS處理的基礎上進一步積累，這個結果表明EBSS處理增加MDA-MB-231細胞的自噬體形成，不影響溶酶體的降解。

ATG7介導ATG12-ATG5共軛系統的形成，參與泛素化反應，是傳統自噬形成的必要途徑。本研究結果中，自噬發生時ATG7 mRNA相對表達量上升，但是ATG7 蛋白表達不改變，這與Wang等[17]結果一致，大部分自噬相關基因表達的增加不依賴于自噬流量。另外，我們的研究發現Baf-A1可降低EBSS處理的ATG7 mRNA相對表達量和蛋白表達，但是在阿霉素誘導自噬的研究中，巴弗洛霉素的阻斷處理不會改變MCF-7細胞中ATG7的表達[18]，這與我們的研究結果相反，這可能是由于細胞異質性導致，但是具體原因還需要進一步探索。哺乳動物巨噬細胞可通過至少兩種不同的途徑發生自噬，包括依賴ATG5/ATG7的常規途徑和不依賴ATG5/ ATG7的替代途徑。ATG7在MDA-MB-231細胞中的表達水平顯示，自噬誘導時ATG7 mRNA表達水平上升，自噬阻斷時ATG7 mRNA和蛋白水平均下降，由此結果表明，ATG7在EBSS誘導MDA-MB-231細胞自噬過程中起到了重要作用，ATG5/ATG7途徑可能是EBSS誘導MDA-MB-231細胞自噬的主要途徑。

ATG4A是半胱氨酸蛋白酶家族的一員，是ATG4的四種亞型之一，是ATG4的一個同源基因，介導LC3BⅠ的加工，從而參與自噬溶酶體的延伸，是調節自噬通量的中心節點。脂化LC3B促進自噬體形成進而結合溶酶體降解胞內的大分子及細胞器，當自噬發生時，ATG4A的表達上調[17]，與我們的結果相反，而且在我們的結果中自噬阻斷時ATG4A表達也沒有發生變化。最新的研究表明ATG4缺陷的細胞中表達高水平的LC3B可以修復SQSTM1/p62的降解缺陷，維持細胞的自噬能力，ATG4的脂化作用不再是自噬小體形成和與溶酶體融合的必要條件[19]。因此推測MDA-MB-231細胞饑餓條件下發生的自噬可能不涉及ATG4對LC3B的脂化，但其具體原因還需要進一步研究。

本研究對ATG7和ATG4A在EBSS處理MDA-MB-231細胞自噬過程中的作用進行了初步的探討，但是這兩個基因在該細胞自噬中的具體作用機制還需要進一步研究。我們將借用siRNA干擾技術分別敲降以上兩個基因的表達水平，探索其在自噬過程中的具體分子機制。另外，除了MDA-MB-231細胞以外，我們也將對其他不同類型乳腺癌細胞自噬過程中ATG7和ATG4A的作用機制進行探索。

綜上所述，EBSS處理的MDA-MB-231細胞自噬水平升高，LC3B、ATG7 mRNA相對表達量升高，ATG4A mRNA相對表達量降低，不影響溶酶體降解，其機制可能為ATG7 mRNA表達升高。