特發性膜性腎病患者血清補體H因子、補體H因子相關蛋白1和補體片段C5a表達觀察

田哲,劉建華,秦曉松,劉勇

中國醫科大學附屬盛京醫院，沈陽110004

特發性膜性腎病(IMN)是原發性成人腎病綜合征的常見病因之一，約占我國成人腎病綜合征患者總數的25%左右，且近年發病率有持續升高趨勢[1]。IMN的致病機制仍不十分明確，補體系統的過度激活導致足細胞損傷被認為是發病機制的關鍵環節[2]。在補體系統已知的三種激活途徑中，凝集素途徑和旁路途經被認為與IMN的發病機制相關。補體H因子(FH)為補體系統旁路途經的主要負向調控因子，可以通過多種方式減弱旁路途經的激活過程。同時補體H因子也具有自身的調節因子：補體H因子相關蛋白1-5，這一類蛋白可以與補體H因子的表面受體競爭性結合，從而干擾H因子對旁路途經的抑制功能，間接調控補體旁路途經的活化[3]。目前關于血清FH、補體H因子相關蛋白1(FHR1)和補體活化的終末產物補體片段C5a在IMN發病中的作用相關報道較少。2018年2月～2019年8月，我們觀察了IMN患者血清FH、FHR1和C5a的表達變化，探討其在IMN發生、發展中可能產生的作用，并總結其與IMN病情之間的關聯性。現報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇同期于中國醫科大學附屬盛京醫院-腎臟內科入院的IMN患者98例(IMN組)，納入標準為首次入院行腎臟穿刺活檢證實為IMN，且入院前未接受過治療；另選擇23例在體檢中心進行健康檢查的健康體檢者，作為健康對照組。

IMN患者中男56例、女42例，年齡(49.46±11.51)歲，血Cr 65.60(55.03，77.93)μmol/L、Urea 4.57(3.42，6.05) mmol/L、Cys-C 1.07(0.92，1.25) mg/L、Uric acid (357.01±97.60 )umol/L、腎小球濾過率eGFR[4]103.37 (95.38，112.83)mL/(kg·1.73 m2)、TP(47.25±7.32)g/L、Alb 24.75(20.50，27.45)g/L、PALB(0.25±0.06 )g/L、A/G1.10(0.90，1.20)、ALT 17.50(13.00，23.25)U/L、AST 18.00(15.00，22.25)U/L、TC 7.30(6.21，9.35)mmol/L、TG 2.15(1.55，3.82)mmol/L、RBC4.50(4.10，4.90)×1012/L、Hb(139.62±16.56)g/L ；健康對照組中男14例、女9例，年齡(52.22±10.27)歲，血Cr 73.10(59.60，75.10)μmol/L、Urea 5.23(4.16，6.08)mmol/L、Cys-C 0.80(0.73，0.87) mg/L、Uric acid (327.66±57.68)umol/L、eGFR 100.26 (93.49，107.39)mL/(kg·1.73 m2)、TP(73.73±3.69 )g/L、Alb 46.30(44.40，49.20) g/L、PALB(0.30±0.05 )g/L、A/G1.75(1.54,1.92)、ALT 19.00(15.00，26.00) U/L、AST 20.00(16.00，23.00)U/L、TC 4.86(4.29，5.94)mmol/L 、TG 1.07(0.93，1.38)mmol/L、RBC4.93(4.60，5.32)×1012/L、Hb(155.74±13.98 )g/L。與健康對照組比較，IMN組血清Cys-C、TC和TG水平升高、血HGB、血RBC計數、A/G、PALB、TP和Alb降低(P均<0.05)，其余指標間差異無統計學意義。

將IMN患者分為少量蛋白尿(24 h尿蛋白<3.5 g/d)者和大量蛋白尿(24 h尿蛋白≥3.5 g/d)者，在大量蛋白尿者中，血清Cr、Cys-C、TC、TG水平顯著高于少量蛋白尿者，而TP、Alb、A/G顯著低于少量蛋白尿者(P均<0.05)。本研究經本院倫理委員會批準，納入者均知情同意。

1.2 血清FH、FHR1及C5a檢測 IMN組于行腎活檢術當日采集靜脈血，健康對照組于體檢當日采集靜脈血，采血2 h內對樣本進行離心分裝，-80 ℃保存備用，避免反復凍融。采用ELISA法檢測血清FH、FHR1和C5a。試劑盒均購自武漢華美生物工程有限公司。實驗過程嚴格按照試劑盒說明書進行。重復3次，取平均值。

2 結果

IMN組血清FH、FHR1、C5a分別為0.52(0.40，0.66)、2.53(1.73，3.49)、2.42(1.23，6.36)，對照組分別為0.57(0.39，0.69)、1.07(0.87，1.64)、0.67(0.56，0.96)，與對照組比較，IMN組血清FHR1、C5a升高(P均<0.05)。少量尿蛋白IMN患者血清FH、FHR1、C5a分別為0.55(0.42，0.73)、 1.73(1.17，2.72)、2.14(1.14，5.03) ，大量蛋白尿IMN患者分別為0.50(0.39，0.63)、 2.83(2.01，3.70)、4.61(1.32，6.59)，與少量蛋白尿IMN患者比較，大量蛋白尿IMN患者血清FHR1水平升高(P<0.05)。

IMN患者血清FHR1、C5a與腎功能生化指標(24 h尿蛋白、Cr、Cys-C、Urea、Uric及eGFR)的相關性分析結果為，IMN患者血清FHR1水平與24 h尿蛋白、Cr和Cys-C均呈正相關(r分別為0.492、0.215、0.371；P均<0.05)，與eGFR存在負相關(r=-0.298；P<0.05)。IMN患者血清C5a水平與24 h尿蛋白、Cr和Cys-C腎功能生化指標均呈正相關(r分別為0.366、0.231、0.253；P均<0.05)，與eGFR存在負相關(r=-0.376；P<0.05)。IMN患者血清FHR1水平與C5a水平呈正相關(r=0.342；P<0.05)。

3 討論

IMN是一種自身免疫性疾病，是成人腎病綜合征最為常見的病理類型之一。補體激活一直被認為是IMN發病機制中的關鍵環節；但到目前為止，補體系統在IMN中的激活依然充滿爭議，是膜性腎病機制研究中亟待解決的兩個主要問題之一[5]。補體系統的激活共有3種途徑：經典途徑、凝集素途徑和旁路途經。目前關于補體系統在IMN中的研究主要集中在凝集素途徑和旁路途經上，早期學者們普遍傾向于凝集素途徑激活為主，但隨著越來越多凝集素途徑缺乏癥患者發展為IMN的病例被報道[6,7]，顯示在缺乏凝集素途徑起始物MBL和Ficolin的情況下，依然可以發生IMN的病理改變，繼而旁路途經則越來越得到重視。起初科研人員分別在IMN患者的腎小球沉積物中發現了補體B因子、P因子和H因子等旁路途經特有的補體分子的存在[6,8,9]；Yang等[11]發現在IMN患者的外周血中，代表旁路途經激活的補體片段Ba和Bb顯著升高，提示補體旁路途經參與了IMN的發病過程。而在Endo等[11]的研究中，IMN患者尿液中FH和膜攻擊復合物C5b-9的水平顯著升高，且在接受治療之后的患者隨訪中，尿液中FH和C5b-9的水平又顯著下降。以上結論均支持補體旁路途經在IMN中的激活過程。所以本次實驗主要聚焦于旁路途經，選取了補體旁路途經中重要的調控分子-FH，以及對其本身起調控作用的FHR1；同時選取了終末途徑活化片段C5a來配合闡述補體H因子及其相關蛋白對IMN可能產生的機制。

FH是補體旁路途經中主要的負向調控因子，可以在液相以及相應細胞的表面起作用，通過3種途徑影響旁路途經的激活：①直接與C3b結合阻止C3轉化酶的形成；②作為Ⅰ因子的輔助因子降解C3b為無生理功能的iC3b；③加速旁路途經C3轉化酶的衰變；而FHR1主要通過2種方式影響H因子對于旁路途經的抑制功能：①干擾FH介導的C3b活化調節功能；②競爭性結合FH的表面配體，作為一種競爭性抑制劑影響FH的功能。FHR和FH之間的相對平衡也影響了補體旁路途經的激活程度。

在本次研究中，我們發現FHR1和C5a在膜性腎病組中的水平顯著高于健康對照組，而FH水平與健康對照組之間無統計學差異。FHR1水平在IMN患者中的升高也反映了補體旁路途經的過度激活：FHR1抑制了FH對于旁路途經的抑制能力，間接導致了補體的過度激活；而終末途徑活化片段C5a在膜性腎病組中的顯著升高也反映了這一過程。在對于FHR1和C5a進一步的相關性分析中，我們也發現FHR1和C5a呈正相關關系，表明FHR1對于補體系統的活化具有調節作用。但是同時我們也發現，FH在IMN組中和健康對照組中沒有顯著性差異，這一現象與以往研究中補體膜攻擊復合物C5b-9在IMN患者血清學中的表達無統計學差異相似[10]。同時有研究[9]表明，FH和C5b-9在IMN患者的病理標本中染色陽性，且在尿液中高表達。所以我們推測造成FH血清學中無統計學差異的原因可能是由于FH在尿液中的丟失所致。當然也有觀點認為補體系統在器官局部的激活造成了組織損傷，但可能并未引起整體循環池中的改變[2]。同時我們也注意到，目前關于補體H因子的研究在其它自身免疫性腎病中也存在一定爭議，比如在IgA腎病中，Onda等[12,13]研究均顯示相較于健康對照組，疾病組血清中FH的水平顯著升高；而在Tortajada等[14]研究報告中，FH在兩組間則不具有統計學差異；所以針對補體H因子的研究還需要進一步的探索。

在對于FHR1和C5a同腎功能生化指標之間的相關性分析中可以看到，FHR1和C5a均與24 h尿蛋白、Cr和Cys-C呈顯著正相關，而與eGFR呈顯著負相關。這也印證了補體旁路途經參與IMN發病機制的想法，隨著FHR1的高表達，相應的腎臟損傷也越重。同時我們也注意到，FHR1與腎功能生化指標之間的相關性在多種腎臟疾病中也被發現要強于其他補體分子[15]，這可能是由于補體分子或片段在補體激活的過程中產生了一定的消耗，從而對其相關性產生影響。24 h尿蛋白定量作為目前評價IMN病情的常用臨床指標，具有一定的延遲性，往往滯后于腎臟損傷的發展；而補體水平的改變則會在發病初期就顯示出來，所以我們推測FHR1和C5a可以作為反映IMN病情的早期指標。

綜上所述，IMN患者血清FHR1、C5a水平升高，補體旁路途徑的活化參與了IMN的發生、發展，且血清FHR1、C5a水平可能與病情有關，血清FHR1和C5a可能成為評價IMN腎臟損傷的有效生物學標志物。