PMEL-17基因在三穗鴨不同組織中的表達

祝永才，楊勝林，譚斌，周璇，楊世皓，羅林麗

(貴州大學 動物科學學院，高原山地動物遺傳育種與繁殖教育部重點實驗室，貴州 貴陽 550025)

三穗麻鴨是貴州省著名的蛋用麻鴨品種，具有產蛋量高、成熟期短、善于行走、覓食能力強等特點，最突出的優點是耐粗飼、產蛋率高、脂肪含量低、肉質細嫩，富含多種人體必需氨基酸等營養成分[1]。已有三穗麻鴨的研究多集中于生產性能、營養成分和疾病預防，其行為學的研究較少。禽類啄羽行為是家禽啄擊同伴羽毛的一種非爭斗性的異常行為[2]。雞、鴨、鵝、鸚鵡等禽類都會表現啄羽行為，被啄的家禽生長緩慢、羽毛殘缺、皮膚出血、潰爛，甚至引起死亡[3]。在高強度生產、集約化養殖的大背景下，蛋禽的啄羽行為對畜牧生產和動物福利造成了不可忽略的負面影響。

前黑素小體蛋白(premelanosome protein-17，PMEL-17)，是黑素小體形成淀粉樣纖維的關鍵蛋白，在黑色素的形成和沉積中發揮重要作用[4-5]。已有研究發現，PMEL-17基因與家禽啄羽行為的發生存在一定的相關性[6-10]。本研究以有啄羽行為和無啄羽行為的三穗鴨為研究對象，分析PMEL-17基因在三穗鴨不同組織中的表達量，一方面是為了研究三穗麻鴨PMEL-17基因在不同組織中表達量規律，另一方面也為進一步探討蛋鴨啄羽行為的發生機制提供依據，在優良家禽育種、生產管理、動物福利等方面都具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

6月齡三穗鴨購自三穗縣兄弟養鴨廠，檢疫合格、健康狀況良好。RevertAid Firt Strad cDNA Synthesis Kit K1621購自北京賽默飛世爾科技有限公司，Ultra SYBR Mixture SYBR GreenⅠ購自北京康為試劑生物科技有限公司。熒光定量PCR儀采用BIO-RAD CFX massage系統。

1.2 方法

1.2.1 處理設計

選取120只三穗鴨置于貴州大學養殖場內進行行為學觀察。分別于上午、下午相同時間，使用行為學軟件Media Record記錄當日三穗鴨是否發生啄羽行為，連續記錄3周。連續不間斷地啄同一只鴨4 s以上時定義為發生啄羽行為，若將羽毛拔出，則定義為重度啄羽行為。根據其有無啄羽行為，將三穗鴨分為啄羽行為組和正常行為組。飼養期間，保證日糧營養充足，自由采食、飲水，定期打掃鴨舍衛生，定期清理糞便并消毒，保持鴨舍良好通風，以保證三穗鴨處于良好的飼養環境。

1.2.2 樣品采集

試驗結束后，隨機選出表現出啄羽行為和表現正常的三穗鴨各3只，采集心、肝、脾、肺、腎、腸、腦、胸、腿、眼、肌胃和腺胃共12個組織樣品，放入凍存管中-80 ℃保存備用。

1.2.3 引物設計

參照NCBI數據庫中GeneBank所公布的雞PMEL-17基因的mRNA序列(登錄號：NM_205112.2)和鴨內參基因β-actin(登錄號：NW_004677060.1)，利用Primer 5.0引物設計軟件設計引物。引物序列由生工生物(上海)有限公司合成。引物優化體系：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，退火30 s，72 ℃延伸30 s，35個循環；72 ℃延伸5 min。引物序列與擴增條件見表1，確定最佳退火溫度為58 ℃。

表1 引物信息

1.2.4PMEL-17基因檢測

采用Trizol法提取樣品總RNA，微量紫外分光光度計測定濃度及D值，采用反轉錄試劑盒反轉錄獲得cDNA第一鏈。采用SYBR GreenⅠ法對PMEL-17基因在各組織中的表達進行實時熒光相對定量分析。反應體系為：混合反應液25 μL，上下游引物各1 μL，cDNA 2 μL，補足ddH2O至50 μL。反應以鴨內參基因β-actin為參照基因，每個組織樣品的目的與內參基因均重復檢測3次。反應程序：95 ℃預變性10 min；95 ℃變性15 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共40個循環；60 ℃ 5 s，90 ℃ 50 s。

1.2.5 數據統計與分析

運用2-ΔΔCt法計算各基因在不同組織中的相對表達量，分析PMEL-17基因在三穗麻鴨各組織中的表達差異。使用Excel 2010統計原始數據，SPSS 18.0進行單因素方差分析，Duncan法進行多重比較，基因表達量以平均數±標準差表示。

2 結果與分析

2.1 總RNA提取檢測

從三穗鴨12個組織中提取總RNA，經微量紫外分光光度計測定，各樣品總RNAD260/D280均在1.80～2.01，D260/D230均在2.0以上，且各組織樣品最大吸收峰值均在260 nm處，說明提取的樣品總RNA純度良好，無蛋白質及其他雜質污染，可用于下一步試驗。

2.2 PMEL-17基因的PCR擴增

三穗鴨部分組織樣品PMEL-17基因的PCR擴增產物用0.5%的瓊脂糖凝膠檢測結果見圖1。從圖1可以看出，PCR產物為一明亮的單帶，產物大小為226 bp，是目的基因。

圖1 PMEL-17基因的PCR產物檢測結果

2.3 熒光定量PCR檢測PMEL-17基因表達

三穗鴨PMEL-17基因在各組織的相對表達量見表2。由表2可知，三穗鴨啄羽組和無啄羽行為組中，PMEL-17基因在各組織樣品中均有表達，腦組織中相對表達量最高，心臟次之，肌胃中的相對表達量最低。

表2 PMEL-17基因在各組織中的相對表達量

除腦、心、胸組織外，啄羽組三穗鴨PMEL-17基因在其他組織中的表達量均低于正常行為組。啄羽組腦組織中PMEL-17基因表達量顯著高于正常組腦組織(P<0.01)。

3 討論

PMEL-17基因是稀釋基因家族成員之一，缺乏PMEL-17基因或表達突變的PMEL基因的動物表現出不同程度的色素減退和色素細胞死亡[11]，是調控動物毛色的主要候選基因[12-13]。彭燦陽[14]研究發現，PMEL17基因的表達豐度影響雪峰烏骨雞黑色素沉積。姚文成等[15]研究發現，PMEL-17基因1904(C/G)、1961(T/C)和2143(A/G)位點基因型分布與鴨羽色具有顯著或極顯著差異。PMEL-17基因在動物組織中表達的研究較少，在動物啄羽行為的組織表達研究還未見報道。

雞羽毛的顏色主要與PMEL-17的基因型有關，其中顯性白、暗褐色和煙熏色是顯性白位點的等位基因，是影響家雞羽毛顏色的主要位點之一。顯性白和暗褐色均抑制黑色真黑素的表達[16]。雞的PMEL-17顯性白是影響羽毛顏色的主要位點之一，利用這一遺傳標記，通過testcross分析鑒定了種系嵌合雞[17]。

雞啄羽行為與羽毛顏色的候選基因PMEL-17相關。白色羽毛母雞在追逐、攻擊、啄食和威脅行為特征上表現出明顯高于紅色羽毛母雞的攻擊性，如果將紅白雞混在一起可以減少攻擊性行為的發生[18]。在排除不良環境影響的情況下，PMEL-17基因型在雞的攻擊行為、探索行為和恐懼行為表現有差異性，并對其有直接影響[8]。Keeling等[10]研究發現，PMEL-17突變可以防止雞的啄羽行為。本試驗中，PMEL-17基因在三穗鴨心、肝、脾、肺、腎、腸、腦、胸、腿、眼、肌胃和腺胃等12個組織中均有表達，且相對表達量存在差異。PMEL-17基因在啄羽組三穗鴨腦組織中表達量最高，與Karlsson等研究結果一致[19]。PMEL-17基因在組織中的表達規律與家禽的啄羽行為的發生具有一定的相關性，推測家禽啄羽行為的發生可能受到腦部某個區域神經的調控，然而其相關性及調控機制還需進一步研究驗證。