富硒葉面肥安全性評估方法建立

耿敬章，陳俊杰，楊萌，孟莉，賀博，唐德劍，楊水云*

(1.西安交通大學生命科學與技術學院，陜西省營養與健康工程研究中心，陜西 西安 710049； 2.陜西理工大學 生物科學與工程學院，陜西 漢中 723000； 3.農業農村部富硒產品開發與質量控制重點實驗室，陜西 安康 725000)

硒是人體必需的微量元素之一，在多種主要代謝途徑中發揮重要的作用，參與人體甲狀腺激素代謝、抗氧化防御系統和免疫功能[1-2]。硒缺乏會導致一系列嚴重疾病的發生，如癌癥、心血管疾病和炎癥等，以及其他自由基相關的問題、過早衰老等[3-12]。

硒在地殼中的分布極不均勻，因此，并不是所有地區的人們都可以僅通過地域性飲水和飲食就獲取滿足人體需求量的硒。芬蘭曾經是一個幾乎全境缺硒的國家，政府經過多年努力，在農田普遍施用硒肥，才逐漸使得芬蘭人的平均硒攝人量達到了推薦標準，是一個人為改變缺硒狀況的成功案例。

目前，我國市場出現了各種硒肥，除根內硒肥外，還有很多速效富硒葉面肥。富硒葉面肥具有無機硒、有機硒和納米硒等多種形式，但其中所含有的硒的形態或比例，僅從外觀上是很難區分判斷的。無機硒具有較高的毒性。直接噴施無機硒將導致大量無機硒殘留，可能導致人畜食用后中毒，具有安全隱患。同時，市場上的硒肥名稱尚未加規范，許多都標有“有機硒肥”，容易誤導使用者。為了建立健全監管機制和手段，亟須建立富硒葉面肥中無機硒占比的測定和評價方法。

本研究擬采用高速離心法去除納米硒，測定上清液中的總硒，用原液總硒和上清液殘留總硒的差值即可得到納米硒占比。取除去納米硒的上清液采用沉淀和有機萃取法去除有機硒，然后測定上清液中的硒含量(即無機硒含量)，計算可得無機硒占比，以快速準確地評估硒肥使用的安全性。現總結報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

以市售有機硒葉面肥作為研究對象。分析檢測中用到的三氯乙酸、NaOH、硼氫化鉀、環己烷、鹽酸、硝酸等試劑均為分析純。

硒標準液，購自國家標準物質中心，質量濃度為1 mg·mL-1。取0.02 mL 1 mg·mL-1的硒標準樣品溶液定容于100 mL，低溫保存。

1.2 儀器設備

主要設備包括：EHD-24電熱消解儀，北京東航科儀儀器有限公司；Mars6高通量密閉微波消解系統，美國CEM公司；LC-AFS 6500液相色譜-原子熒光聯用儀，北京海光儀器有限公司；UV-8000S紫外可見分光光度計，上海元析儀器有限公司。

1.3 溶液配制

20 g·L-1硼氫化鉀堿溶液：20 g硼氫化鉀，溶于NaOH溶液(5 g·L-1)中混勻，現配現用。

三氯乙酸母液(300 g·L-1)，用時稀釋。

1.4 硒肥中總硒含量的測定

參照GB 5009.93—2017對硒肥原液中的總硒含量進行測定，計為C0，單位為mg·L-1。

1.5 硒肥中納米硒含量測定

觀察所購買的富硒葉面肥發現，硒肥呈紅色液體且底部有紅色沉淀，推斷產品中含有納米硒。將富硒葉面肥溶液在13 000g的條件下高速離心10 min，去除溶液中的納米硒顆粒。矯正溶液體積等同出發溶液體積后測定無納米硒上清液中的總硒含量(C1)，則納米硒含量Cn=C0-C1，納米硒占比為(C0-C1)/C0。

1.6 硒肥中無機硒占比測定

取無納米硒的上清液，加入三氯乙酸，使其終濃度為15%，劇烈混勻，10 000g高速離心15 min，去除可能的有機硒蛋白沉淀，取蛋白上清液加入環己烷，萃取可能存在的小分子有機硒，劇烈混勻后靜置，觀察環己烷和水相之間的界面，以界面清晰狹窄為終點，否則需要在去除有機相后重復萃取。

收集全部水相，待定容體積與出發溶液體積一致后測定其中的總硒含量，視為無機硒含量Ci。無機硒與總硒的比值(Ci/C0)即為無機硒占比。

1.7 方法的加樣回收率與精密度測定

利用加樣回收率來衡量方法的準確度。實驗分組：一組加入標準樣和稀釋后的硒肥樣品，加樣量分別為待測硒含量的80%、100%和120%，每組實驗平行3次；第二組直接測定稀釋后的硒肥樣品。2組待測樣品分別用上述方法測定硒含量，最終計算出回收率和相對標準誤(RSD)。理論上，加樣回收率不應低于80%。

2 結果與分析

2.1 硒標準工作曲線

設置系列標準濃度(1.0～20 μg·L-1)，使用儀器自動稀釋。以質量濃度為橫坐標(x)、熒光強度為縱坐標(y)，制作標準曲線，擬合的標準曲線為y=122.68x-91.10，決定系數R2=1.000 0，可利用此標準曲線測定硒肥中的硒含量。

2.2 硒肥中的總硒含量

對硒肥原液進行稀釋度優化，使測定結果落在工作曲線范圍內。經優化，在10-4稀釋度下進行富硒葉面肥總硒含量測定，5次測定結果的平均值為(6 004.08±21.78)mg·L-1，與其說明書標注的總硒含量≥5 000 mg·L-1相符，測定結果的RSD為3.62%。

2.3 硒肥中的納米硒含量

取樣品稀釋度為10-4的硒肥溶液，13 000g高速離心10 min，取上清液測定C1為(2 061.40±84.00)mg·L-1，與總硒含量的差即為納米硒含量，理論計算Cn為3 942.68 mg·L-1，納米硒占比為65.67%。

2.4 硒肥中的無機硒含量

取稀釋度為10-4的樣品稀釋液，與體積分數為30%的三氯乙酸溶液等體積混合，使三氯乙酸的終體積分數為15%。按照前述方法去除有機硒，測得硒肥中Ci為(2 060.00±96.00)mg·L-1，6次測定結果的RSD為1.93%。計算可知，無機硒占比為34.31%。

以上測定結果表明，所測硒肥中硒形態主要是納米硒，在總硒中的占比為65.67%，無機硒占比34.31%左右，二者之和幾乎與總硒相等，同時，離心上清液采用三氯乙酸沉淀蛋白和環己烷萃取物，進行硒含量測定，硒未檢出，說明硒肥中幾乎不含有機硒成分。

2.5 方法的加樣回收率與精密度

根據測定結果，計算加樣回收率與精密度，結果見表1。經測算，平均加樣回收率為98.83%，RSD為1.47%，完全可滿足實驗檢測要求，說明用此方法測定硒肥中的無機硒含量準確可靠。

表1 檢測方法的加樣回收率

3 小結

市售硒肥多標稱為有機硒肥，但其中的無機硒常占很大比例，而相對于納米硒和有機硒，無機硒毒性較高，因此，檢測硒肥中的無機硒含量對于評價硒肥安全性十分必要。采用超高速離心的方法去除納米硒，用三氯乙酸沉淀蛋白、環己烷萃取小分子有機物的方法去除有機硒，建立起一套適用于富硒葉面肥中納米硒和無機硒含量檢測的方法。經測試，該方法的加標回收率為98.83%，RSD為1.47%，說明所建立的方法是可信的。通過所建方法，測得市售某富硒有機肥中總硒濃度為(6 004.08±21.78) mg·L-1，與其說明一致，其中納米硒占比為65.67%，無機硒占比為34.31%，幾乎不含有機硒，可見所標稱的有機硒肥并不是真正意義上的有機硒肥。本實驗為硒肥中無機硒含量占比檢測提供了思路，在肥料安全性監管和農產品質量控制方面具有積極的現實意義。