楠藤綠原酸超聲輔助法提取優化研究

周家紅 劉銳 張欣 辛瑞瑞 杜繼恒

【摘? ?要】 楠藤作為民間和民族常用藥，有著良好的藥用開發前景。采用正交試驗法三因素三水平，即超聲時間，超聲溫度，乙醇濃度三個影響因素，每個因素三個水平，最大的影響因素為提取時間，其次為乙醇濃度，最小影響因素則為提取溫度。最佳工藝組合為A3B3C1，該提取工藝操作簡便，為提取楠藤葉中綠原酸提供理論依據，從而證實其具有抗炎性作用。

【關鍵詞】 楠藤;綠原酸;正交試驗;抗炎

楠藤（Musaenda erosa Champ ），為茜草科玉葉金花屬攀援灌木植物，其性涼，味微甘。又名厚頁白紙扇、大茶根、大洋藤、膠鳥藤、大白紙扇、火燒藤等，常攀援于疏林喬木樹冠上，在我國常分布于廣東、香港、廣西、云南、四川、貴州、福建、海南和臺灣等地區。具有清熱消炎功效，可治熱疥瘡，海南民間常用于治療各種炎癥[1]。其作為民間和民族常用藥，有著良好的藥用開發前景。為了更好地利用楠藤中的綠原酸，減少原材料的浪費， 研究楠藤中綠原酸的提取工藝具有重要意義.本試驗通過正交試驗，采用超聲提取法提取楠藤中的綠原酸， 以不同的超聲時間、不同的超聲溫度、不同的乙醇濃度為提取溶劑，探討其提取過程中的顯著影響因素，并進一步確定楠藤中綠原酸的最佳提取工藝參數，為后期相關研究和工業生產提供理論依據。

1? 儀器與材料

超聲波清洗器（上海寧商超聲設備有限公司? 型號：KQ-250B）、分析天平（上海精密科學儀器有限公司 型號：FA2004N）、紫外可見分光光度計（日本島津? 型號：UV-2450），試藥為經當地經驗豐富的藥農實地采集。

2? 試驗方法

2.1? 對照品溶液的制備[2～5]

精密稱取1mg綠原酸標準品，置于10mL容量瓶中，加50%乙醇至刻度線，配制成0.1mg/mL的對照品溶液，即為對照品溶液。

2.2? 綠原酸的提取

準確稱取楠藤葉粉末1g，按1：10的料液比向錐形瓶中加入不同濃度的乙醇，輕微搖晃，使粉末充分溶于溶液中，按照設定的超聲浸提時間和超聲浸提溫度進行超聲提取。將提取液進行過濾，取0.1mL濾液移至10mL容量瓶中，加50%的乙醇至刻度線，即為供試待測樣品溶液。吸取各供試品溶液，，置于比色池中，在330 nm處測定不同供試品溶液的吸光值。

計算公式：提取率（%）=C（mg/ml）x稀釋倍數x提取液體積/樣品質量

C—提取液濃度

V—提取液體積

2.3? 單因素試驗設計

2.3.1 提取溫度對提取綠原酸的影響? 準確稱取1g楠藤葉粉末5份，按按1：10（g/mL）的料液比向錐形瓶中加入50%的乙醇，輕微搖晃，使粉末充分溶于溶液中，按“2.2”中的方法進行提取，條件為：超聲時間為30min，溫度分別為50℃、60℃、70℃、80℃、90℃。計算綠原酸的提取率，考察提取溫度對綠原酸提取率的影響。

2.3.2 提取時間對提取綠原酸的影響? 準確稱取1g楠藤葉粉末5份，按按1：10（g/mL）的料液比向錐形瓶中加入50%的乙醇，輕微搖晃，使粉末充分溶于溶液中，按“2.2”中的方法進行提取，條件為：超聲溫度為70℃，時間分別為20min、30min、40min、50min、60min。計算綠原酸的提取率，考察提取時間對綠原酸提取率的影響。

2.3.3 乙醇濃度對提取綠原酸的影響? 準確稱取1g楠藤葉粉末5份，按按1：10（g/mL）的料液比向錐形瓶中加入濃度分別為40%、50%、60%、70%、80%的乙醇，輕微搖晃，使粉末充分溶于溶液中，按“2.2”中的方法進行提取，條件為：超聲溫度為70℃，超聲時間為30min。計算綠原酸的提取率，考察乙醇濃度對綠原酸提取率的影響。

2.4? 正交試驗

根據單因素試驗結果，以提取液中的綠原酸含量為考察指標，對提取溫度、提取時間、乙醇濃度3個因素優選，每個因素設3個水平，用L9（33）正交試驗表進行試驗，方案見表1。

2.5? 統計學方法

試驗數據采用統計學軟件SPSS17.0進行處理，進行方差分析，以Sig<0.05為差異具有顯著統計學意義。

3? 試驗結果與分析

3.1? 標準曲線的繪制

分別汲取2.0mL、2.5mL、3.0mL、3.5mL、4.0mL對照品溶液，置于25mL的容量瓶中，加50%的乙醇至刻度線。以50%乙醇溶液做空白，于紫外可見分光光度計330 nm處測定吸光值，以吸光值為縱坐標，濃度為橫坐標，經方程回歸分析，得綠原酸標準曲線回歸方程為Y=23.15X+0.051，對照品溶液在8-16μg /m L范圍內呈現良好的線性關系，相關系數R2=0.9967，見圖1。

3.2? 單因素試驗結果與分析

3.2.1 提取溫度對提取綠原酸的影響? 由圖2可知，隨著超聲溫度的增加，綠原酸的提取率持續增大。當提取溫度為80℃時，其提取率為3.62%，達到最大值。

3.2.2 提取時間對提取綠原酸的影響? 由圖3可知，隨著提取時間的延長，綠原酸的提取率也隨之增大。當提取時間為50 min時，其提取率為3.66%，達到最大值。此后，再增加提取時間，綠原酸提取率下降。因此，選擇提取時間50 min比較適宜。

3.2.3 乙醇濃度對提取綠原酸的影響? 由圖4可知，隨著乙醇濃度的增大，綠原酸的提取率先增加后減小。當乙醇濃度為50%時，其提取率為3.62%，達到最大值。此后，繼續增大乙醇的濃度，綠原酸的提取率反而降低。乙醇濃度較低時，楠藤中的綠原酸不能充分溶出;濃度過高時，楠藤中能夠溶解于乙醇中的其他雜質也被溶解了出來，造成綠原酸提取率下降。因此，選擇50%的乙醇濃度較為合適。

3.3? 正交試驗結果與分析

通過對單因素試驗結果的分析，以綠原酸提取率為評價指標，采用正交試驗優化提取工藝，正交試驗設計及結果見表2，方差分析見表3。

由表2直觀分析，通過R值可知楠藤中綠原酸的超聲提取最大影響因素為提取時間，其次是乙醇濃度，而提取溫度則較小影響因素。根據K值知提取溫度A3>A1>A2，提取時間B3>B1>B2，乙醇濃度C1>C2>C3，由此可知楠藤中綠原酸超聲提取的最佳工藝為A3B3C1。即超聲溫度80℃、提取時間50 min、40%乙醇的濃度。

由SPSS軟件分析得到表3可知，P值大小依次為提取時間<乙醇濃度<提取溫度，各影響因素P值均<0.05，均有相關顯著性。

對最佳工藝進行3次驗證試驗，得到綠原酸的平均提取率為4.57%，相對平均偏差為0.25%，表明最佳工藝正確、穩定。

4? 結論

在相關研究中已經得到證實，綠原酸對多種致病菌和病毒有較強的抑制和殺滅作用[6]，并且可能通過抑制TLR4/NF-κB信號通路的活化來減少脂多糖誘導AKI的促炎癥細胞因子[7]，且降低脂多糖誘導的COX-2的蛋白水平也是綠原酸抗炎的機制之一[8]。綠原酸含量的高低，是關乎楠藤內在質量的標準之一，與藥用價值有著直接聯系。本試驗采用了超聲波提取法、正交設計法來研究楠藤葉中綠原酸提取最佳工藝條件。先對超聲波提取楠藤中綠原酸的工藝條件進行單因素優化，確定了影響顯著因子及各因子最適水平，再在此基礎上進行正交優化，并對正交試驗結果進行方差分析， 確定了超聲波法提取楠藤中綠原酸的最佳工藝，為A3B3C1，即提取溫度80℃，提取時間50min，乙醇濃度40%。采用該方法提取楠藤中的綠原酸具有快速、省時、成本低、效率高等優點。試驗對楠藤中的綠原酸進行提取工藝優化，證實楠藤綠原酸含量較高。楠藤作為植物提取類藥物，不僅藥物副作用小，而且還增加了抗炎類藥物品目，從而減輕了目前各類抗炎性藥物長期服用耐藥性問題，具有廣闊的抗炎性藥物開發前景。

對楠藤進行藥理試驗研究，對其抗炎療效還需進行相關試驗，并進一步明確其抗炎機理過程。

參考文獻：

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（編輯：李丹）