靈芝三萜類化合物對砷中毒大鼠海馬組織形態學及腦組織中AChE和ChAT含量的影響*

張玥，陳林，謝春，楊小雪，羅俊，羅喜榮

(1.貴州醫科大學 貴州省特色天然藥物資源高效利用工程研究中心 & 天然藥物資源優效利用重點實驗室，貴州 貴陽 550025； 2.貴州醫科大學 基礎醫學院 藥理學教研室，貴州 貴陽 550025； 3.黔南民族醫學高等專科學校 藥理學教研室，貴州 都勻 558013； 4.貴州醫科大學 公共衛生學院 職業衛生與環境衛生學系，貴州 貴陽 550025； 5.黔東南州疾病預防控制中心，貴州 凱里 556000； 6.貴州醫科大學 藥學院，貴州 貴陽 550025)

砷是廣泛存在于環境中的有毒致癌金屬元素[1]，近幾十年，慢性砷暴露人群急劇增多[2-3]。長期砷暴露可致多系統損害[4]，砷主要蓄積在皮膚及肝臟，通過血腦屏障進入腦組織的砷很少，因此多年來對砷致中樞神經系統影響研究較少。砷中毒可以引起腦組織氧化損傷[5]、腦組織神經遞質代謝酶紊亂[6]及腦中海馬組織病理學變化[7]等損害。已有研究證實，砷中毒可以導致膽堿能系統的破壞[8]。因此改善砷中毒引起的海馬組織病理學變化及保護中樞膽堿能系統功能可能是治療砷中毒的有效措施。靈芝三萜類化合物(Ganodermalucidumtriterpenoids，GLT)具有廣泛藥理活性，如抗腫瘤、保肝排毒、抗HIV病毒以及降低膽固醇等作用[9-11]，作者所在課題組前期研究證實GLT對AD大鼠模型海馬組織病理學病變有一定的調節保護作用[12]，并可調節膽堿能系統的平衡[13]。因此，本研究采用高、中、低3種濃度的GLT處理砷中毒模型動物，觀察處理后模型動物海馬組織形態學變化及GLT對模型大鼠腦組織乙酰膽堿酯酶(AChE)、乙酰膽堿轉移酶(ChAT)活性變化的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

亞砷酸鈉(NaAsO2)購自Sigma公司，GLT由中國科學院地球化學研究所超臨界流體技術研究中心提取(GLT溶液用金龍魚食用油溶解配制)，HE染色液購自北京Solarbio公司，4%多聚甲醛購自美國Bio-World公司，AChE試劑盒和ChAT試劑盒購買于南京建成生物工程有限公司。DMi 1倒置顯微鏡(德國Leica公司)、Microfuge ?20R冷凍離心機(美國Beckman coulter公司)、WP-UP-11-20超純水機(四川沃特爾水處理設備有限公司)。

1.2 實驗動物及分組

SD大鼠60只(貴州醫科大學動物實驗中心提供，批準號1503145)，體質量為(100±20)g，飼養于自然晝夜交替環境，在適應性喂養1周后，將其隨機分為5組，每組12只，雌雄各半，分為正常對照組(生理鹽水，10 mL/kg)、模型組(NaAsO210 mL/kg)、GLT低劑量組(GLT 0.25 g/kg+NaAsO210 mg/kg)、GLT中劑量組(GLT 0.50 g/kg+NaAsO210 mg/kg)、GLT高劑量組(GLT 1.00 g/kg+NaAsO210 mg/kg)，按上述各組給藥劑量進行灌胃給藥，1次/d，連續給藥90 d。按照40 mg/100 g的麻醉劑量依組別把大鼠進行腹腔注射麻醉，并迅速斷頭處死，取出大腦以矢狀面為界均分大腦為兩半，其中一半腦組織，取視交叉后 5 mm厚的矢狀位腦片(包含海馬)。

1.3 觀察指標

1.3.1腦組織中AChE、ChAT活性檢測 每1 g腦組織中加入預冰的生理鹽水9 mL，用勻漿器制備勻漿，離心備用。按照光化學法試劑盒提供方法步驟測定AChE，ChAT活性。

1.3.2海馬蘇木精-伊紅(HE)染色觀察 將分離出來的海馬組織放入對應組別的小皿中(小皿中提前加入預冷的4%多聚甲醛磷酸緩沖鹽溶液)固定過夜，使用70%、85%及100%酒精進行梯度脫水，二甲苯透明20 min，常規石蠟包埋切片，HE染色，封片拍照。

1.3.3海馬電鏡切片觀察 取出的海馬組織經2.5%戊二醛固定2 h后，磷酸緩沖液清洗3次，1%鋨酸固定1 h，70%、85%及100%丙酮分別脫水10 min，環氧丙烷浸透，環氧樹脂包埋，聚合后超薄切片機切片，最后進行透射電鏡攝片觀察記錄。

1.4 統計學方法

2 結果

2.1 大鼠腦組織勻漿中AChE、ChAT的表達

與正常對照組相比，模型組中AChE活力明顯升高，ChAT活力明顯降低，差異有統計學意義(P<0.05)。給予GLT干預后，與模型組相比，AChE活力明顯降低，ChAT活力明顯升高，差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 GLT對大鼠腦組織AChE和ChAT活力的影響Tab.1 Effects of GLT on the AChE and ChAT activity in the brain of

2.2 大鼠海馬組織HE染色結果

海馬組織HE染色結果顯示，正常對照組海馬組織細胞數量多，形態完整，排列有序；而模型組海馬組織細胞數量明顯減少，排列重度紊亂，神經元結構變性部分腦組織出血；GLT低劑量組海馬組織細胞數量與模型組相比，明顯增多，細胞出現輕度紊亂；GLT中、高劑量組海馬組織細胞數量及細胞形態趨近于正常對照組細胞。見圖1。

正常對照組 模型組 GLT低劑量組 GLT中劑量組 GLT高劑量組圖1 大鼠海馬組織HE染色(40×)Fig.1 HE staining of hippocampus in rats(40×)

2.3 大鼠海馬組織電鏡觀察

正常對照組海馬組織細胞完整，核膜連續，細胞器豐富；而模型組海馬組織細胞腫脹，細胞核膜不連續，細胞質內細胞器明顯減少，線粒體腫脹、內質網破壞嚴重；當給予GLT干預后，細胞水腫明顯減輕，細胞質內細胞器明顯增多，內質網破壞及線粒體腫脹得以明顯改善。見圖3。

正常對照組(4 000×) 模型組(7 000×) GLT中劑量組(4 000×) GLT高劑量組(5 000×) 圖2 大鼠海馬組織透射電鏡觀察Fig.2 The transmission electron microscope examination of hippocampus in rats

3 討論

砷中毒已經成為世界上的一個嚴重的公共衛生問題，特別是在孟加拉國、印度、中國和日本[14-15]。然而，全世界估計有1億人通過飲用水接觸過量的砷引起中毒，并且砷中毒幾乎影響機體的每個器官系統，包括大腦。在許多流行病學研究中，砷中毒已被證明會增加神經系統紊亂的發生[16-17]。據報道，砷能夠穿過血腦屏障，影響基底神經節，海馬及大腦皮層受損[18]。大腦作為機體中最重要器官之一，大腦中的海馬組織是機體進行學習記憶、認知等高級神經活動的重要區域[19]，當其受到砷中毒引起的病理學病變時，會導致機體學習記憶功能障礙、神經系統調節紊亂等一系列健康問題[20]。然而在本研究中發現在NaAsO2引起的砷中毒大鼠模型中，模型組大鼠海馬組織發生嚴重病理學病變，如神經元變性、部分海馬組織出血、海馬組織結構排列紊亂以及膠質細胞增生。當給予GLT干預后，能夠逆轉砷中毒導致的海馬組織的病理學病變，表明GLT能夠對砷中毒引起的大鼠海馬組織的病理學病變有一定的保護作用。

據文獻報道，砷中毒后AChE活性升高[21]。另一項研究表明，AChE活性隨著大鼠砷濃度的增加而活性升高[22]。這些報道均證實了砷中毒可以引起膽堿能功能異常。然而，在本研究中發現模型組大鼠中AChE活力明顯升高，ChAT活力明顯降低，當給予GLT干預后，能夠顯著抑制砷中毒引起的AChE活力升高，ChAT活力降低。

綜上所述，砷中毒可以引起大鼠海馬組織病理學病變的發生及膽堿能功能異常升高，GLT能夠逆轉砷中毒可以引起大鼠海馬組織病理學病變及改善膽堿能功能，靈芝三萜類化合物GLT可能將會成為一個治療砷中毒的潛在藥物。