凝血因子Ⅱ G20210A、Ⅴ G1691A及Ⅶ R353Q基因多態性與上海漢族人群急性腦梗死的相關性*

岳孟孟，于芳蘋，趙迎春**

(1.南京醫科大學上海松江臨床醫學院 神經內科，上海 201600； 2.南京醫科大學上海松江臨床醫學院 老年科，上海 201600)

急性腦梗死(acute cerebral infraction，ACI)是由腦組織缺血引起的一系列病理改變及神經功能障礙性疾病[1]，目前認為ACI是一種受環境與遺傳等多因素共同作用的疾病，凝血與抗凝系統失衡是其發生的重要原因。正常機體凝血與抗凝系統處于動態平衡狀態，一旦失衡則可能引起血栓或出血[2]。研究表明，凝血因子Ⅱ(coagulation factor Ⅱ，FⅡ)G20210A多態性可導致血漿凝血酶原水平升高，促進纖維蛋白聚合，加速血栓形成[3]；凝血因子Ⅴ(coagulation factor Ⅴ，FⅤ)G1691A突變可導致活化蛋白C抵抗(activated protein C resistance，APCR)，APCR患者對活化的凝血因子Ⅴ(activated coagulation factor Ⅴ，FⅤa)的滅活作用減弱，從而導致機體的高凝狀態[4]；凝血因子Ⅶ(coagulation factor Ⅶ，FⅦ)R353Q在啟動外源性凝血途徑中起關鍵作用，FⅦ不僅參與凝血的啟動，還參與血管新生、傷口愈合、炎癥反應及動脈粥樣硬化等過程，FⅦR353Q突變的機體FⅦ水平明顯升高，這也是機體高凝狀態的原因之一[5-6]。由此看出FⅡG20210A、FⅤG1691A及FⅦR353Q多態性在血栓相關性疾病中起到重要的作用。但由于FⅡG20210A、FⅤG1691A的低突變率與ACI之間的關系仍不明確，FⅦR353Q的Q等位基因突變是保護性因素還是危險性因素也存在爭議。因此，本研究采用聚合酶鏈式反應-限制性片段長度多態性(polymerase chain reaction-ligase detection reaction, PCR-LDR)及多重連接酶檢測分型(multiple ligase detection reaction, Multiple LDR)技術分析上海漢族人群ACI人群FⅡG20210A、FⅤG1691A及FⅦR353Q多態性的分布情況，現將結果匯報如下。

1 對象和方法

1.1 對象、主要試劑與儀器

1.1.1研究對象 選取2018年1月—2019年6月神經內科住院的ACI確診的漢族患者作為ACI組，均行頭顱CT和(或)MRI檢查、且符合2018年中國急性缺血性腦卒中診療指南ACI診斷標準；選取同期健康漢族人群作為對照組，2組研究對象均排除近期有顱腦損傷、腫瘤、手術、自身免疫性疾病及嚴重心、肝、腎功能不全者。ACI組共納入患者180例，男性99例、女性81例，平均年齡(71.74±9.63)歲，ACI病因分型(trial of org in acute stroke treatment ，TOAST)分別為大動脈粥樣硬化型腦梗死(large-artery atherosclerosis, LAA)、小動脈硬化性腦梗死或腔隙性腦梗死(small-artery occlusion，SAO)及心源性腦梗死(cardioembolism，CE)各有65例、84例及31例；對照組正常人150例，男73例、女77例，平均年齡(70.06±9.17)歲。2組被檢者的年齡、性別比較，差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。

1.1.2主要試劑和儀器 脫氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid，DNA)提取試劑盒(美國Omega)，聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction,PCR)引物(上海生工)，PCR擴增體系(50 μL)、Marker及Loading buffer(日本寶日)，焦碳酸二乙酯(diethy pyrocarbonate，DEPC)水(上海碧云天)，瓊脂糖(美國AMERSCO)，限制性核酸內切酶HindⅢ(restriction endonucleaseHindⅢ，HindⅢ)、限制性核酸內切酶MspⅠ(restriction endonucleaseMspⅠ，MspⅠ)、限制性核酸內切酶MnlⅠ(restriction endonucleaseMnlⅠ，MnlⅠ)及Buffer Tango(美國ThermoFisher Scientific)，APCR試劑盒(美國Instrumentation )；凝膠成像系統(美國Bio-Rad)。

1.2 方法

1.2.1一般資料收集 收集ACI組和對照組研究對象的臨床資料，包括年齡、性別、血糖、收縮壓、舒張壓、甘油三酯、總膽固醇、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、載脂蛋白A、載脂蛋白B、脂蛋白a、吸煙史、飲酒史、高血壓及糖尿病病史。

1.2.2DNA提取 分別抽取ACI組和對照組被檢者入院或體檢時的清晨空腹外周血2 mL，檸檬酸鈉抗凝，離心后下層血細胞用于DNA提取，上層血漿置于-80 ℃冰箱保存備用；使用DNA提取試劑盒提取DNA，具體操作步驟按照說明說嚴格進行；采用分管光度計法測量DNA提取物的濃度及純度，并將提取的DNA置于-80 ℃冰箱中保存備用。

1.2.3PCR擴增 引物設計使用Primer5軟件，由上海生工生物公司合成(表1)。PCR擴增體系(50 μL)：Prime STAR Max Premix(2×) 25 μL ，樣本基因組DNA 2 μL(100 ng)，上、下游引物各1 μL(10-12moL/L)，DEPC水定容至50 μL。PCR反應條件為98 ℃預變性3 min，98 ℃變性10 s，退火10 s，72 ℃延伸1 min，共35個循環，72 ℃末次延伸10 min。取PCR產物10 μL和6×loading buffer 2 μL混合后，進行2%瓊脂糖凝膠電泳，應用凝膠成像系統拍照。余PCR產物置于-20 ℃保存。

表1 基因位點引物Tab.1 Gene primer sequences

1.2.4酶切及電泳 取PCR產物10 μL、10×Buffer Tango2 μL、核酸內切酶(FⅡ反應體系加入HindⅢ，FⅤ反應體系加人MnlⅠ，FⅦ反應體系加入MspⅠ) 2 μL，定容至20 μL，置于37 ℃溫箱12 h；取酶切產物10 μL和6×loading buffer 2μL混合后，進行2%瓊脂糖凝膠電泳，應用凝膠成像系統拍照。

1.2.5多重連接酶檢測基因型 PCR產物使用Multiple LDR進行單核苷酸多態性(single neucleotide polymorphisms，SNP)分型，由上海翼和應用生物技術有限公司完成。

1.2.6APCR測定 將保存于-80 ℃冰箱的血漿取出，進行APCR測定，使用APCR試劑盒，結果以活化蛋白C比率(activated protein ratio，APC ratio)表示，通過計算加APC的血漿活化部分促凝血酶原激活(activated partial thromboplastin time，APTT)值與不加APC的血漿APTT值的比值得到，正常范圍為2.61～3.32，超出上限為APCR陽性[7]。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 Hardy-Weinberg平衡檢驗

ACI組與對照組被檢者間FⅡG20210A、FⅤG1691A及FⅦR353Q多態性符合Hardy-Weinberg平衡(P>0.05)，說明本研究被檢者為一遺傳平衡群體，具有群體代表性。

2.2 基線資料

ACI組患者的收縮壓、血糖水平、高血壓病、糖尿病及吸煙比例均高于對照組(P<0.05)，但高密度脂蛋白水平低于對照組(P<0.05)。見表2。

表2 ACI組與對照組研究對象基線資料的對比Tab.2 The comparison of basic data between the ACI group and the control group

2.3 PCR-RFLP及Multi-LDR分型

FⅡ 基因G20210A的PCR產物經過HindⅢ酶切之后，瓊脂糖凝膠電泳僅顯示一條320 bp的單一條帶，提示ACI組和對照組無基因突變(圖1A)；Multi-LDR結果與PCR-RFLP結果一致，僅檢測出單峰GG基因型，G等位基因的LDR產物長度為97 bp(圖1B)。FⅤG1691A的PCR產物經過MnlⅠ酶切之后顯示2種條帶：第1泳道為GA雜合型(353 bp、205 bp和148 bp)，第2、3泳道為GG純合突變型(353 bp)，ACI組及對照組研究對象均未檢測出AA純合突變基因型(圖2A)；Multi-LDR結果與PCR-RFLP結果一致，僅檢測出GG與GA基因型，未檢測出AA基因型，GG基因型純合子為單峰，GA基因型雜合子為雙峰，等位基因G的LDR產物長度為76 bp，等位基因A的LDR產物長度為74 bp(圖2B、2C)。FⅦR353Q的PCR產物經過MspⅠ酶切之后顯示3種基因型：第1、2泳道為GA雜合突變型(291 bp、223 bp和68 bp)，第3泳道為AA野生型(291 bp)，第4泳道為GG純合突變型(223 bp和68 bp)(圖3A)；Multi-LDR結果與PCR-RFLP結果一致，RR及QQ基因型純合子為單峰，RQ基因型雜合子為雙峰，等位基因R的LDR產物長度為79 bp，等位基因Q的LDR產物長度為81 bp(圖3B、3C及3D)。

2.4 基因頻率及等位基因頻率

ACI組及對照組研究對象外周血FⅡG20210A未檢測到A等位基因的變異，FⅤG1691A僅檢測到GA雜合變異型1例；ACI組與對照組相比FⅦR353Q基因型及等位基因頻率比較，差異有統計學意義(P<0.05)；TOAST分型中SAO組與對照組，比較差異有統計學意義(P<0.05)。見表3。

注：A圖為HindⅢ酶切電泳結果，1、2、3及4為GG基因型電泳的泳道；B圖為GG基因型LDR結果(sz97.54、ht13143)。圖1 FⅡ 基因G20210A的HindⅢ酶切電泳和LDR結果Fig.1 FⅡ G20210A PCR products digested by HindⅢ in agarose gel electrophoresis and LDR

注：A為MnlⅠ酶切電泳結果，1為GA基因型電泳的泳道，2、3為GG基因型電泳的泳道；B圖為GG基因型LDR結果(sz76.27、ht13154)；C圖為GA基因型的LDR結果(sz74.38、ht5973，sz76.32、ht6470)。圖2 FⅤ G1691A的MnlⅠ酶切電泳結果LDR結果Fig.2 FⅤ G1691A PCR products digested by MnlⅠ in agarose gel electrophoresis and LDR

注：A圖為MspⅠ酶切電泳結果，1、2為RQ雜合突變型電泳的泳道，3為RR純合子電泳的泳道，4為QQ純合突變型電泳的泳道；B圖分別為RR基因型的LDR結果(sz79.55、ht10350)；C圖為RQ基因型的LDR結果(sz79.57、ht6361，sz81.36、ht5907)；D圖為QQ基因型的LDR結果(sz81.21、ht14916)。圖3 FⅦ R353Q的MspⅠ酶切電泳結果Fig.3 FⅦ R353Q PCR products digested by Msp Ⅰ in agarose gel electrophoresis

表3 FⅦ G1691A基因型及等位基因頻率比較Tab.3 FⅦ G1691A genotypes and allele frequencies between the ACI group and the control group

2.5 APCR

ACI組患者APCR陽性率高于對照組(P<0.05)。見表4。

2.6 ACI危險因素分析

將ACI組及對照組的多項基本臨床資料及實驗室檢查結果合并，進行二分類賦值，將賦值結果納入二分類Logistic回歸分析中，進行危險因素分析。結果顯示，吸煙、高血壓、低水平高密度脂蛋白、FⅦR353Q基因型及APCR是ACI的獨立危險因素(P<0.05)。見表5。

表4 ACI組及對照組被檢者APCR比較Tab.4 The comparison of APCR between the ACI group and the control group

表5 ACI的二分類Logistic回歸分析Tab.5 Binary Logistic regression analysis of ACI

3 討論

FⅡ基因位于11號染色體，G20210A突變是指FⅡ基因3′-非編碼區20210位點核苷酸鳥嘌呤(G)突變為腺嘌呤(A)，該位點突變可上調血漿中FⅡ增加，從而抑制纖溶過程，促進血栓形成。一項關于缺血性腦卒中各亞型的蛋白標志物的研究發現，纖溶、凝血與凋亡通路與所有亞型的腦梗死顯著相關，且FⅡ與纖溶酶原是LAA、SAO及CE等各型腦梗死的關鍵蛋白，FⅡ與纖溶酶原參與凝血級聯反應，血管內皮受損及動脈粥樣硬化斑塊形成導致血管內凝血級聯反應失調，血供減少或者中斷，與各種亞型腦梗死的發生密切相關[8]。FⅤG1691A因其可以導致APCR而使機體產生高凝狀態，因此FⅤG1691A基因多態性及APCR可能是靜脈血栓性疾病的危險因素。研究表明FⅤG1691A也與動脈型缺血性疾病有關，Kita等[9]對野生型、突變雜合子及突變純合子雄性小鼠進行腦梗死造模，發現與野生型相比，突變的雜合子與純合子小鼠表現出較大的腦梗死體積與較低的生存率，這可能是由于FⅤG1691A突變導致機體的高凝狀態，加重了腦梗死小鼠病灶的缺血再灌注損傷，由此推測，FⅤG1691A可能影響動物腦梗死的進程及其預后。

有研究發現FⅡ G20210A及FⅤ G1691A基因多態性存在地區和種族的差異，白人中的突變率較高，南歐較北歐高，而在亞洲及非洲較低[10]。本研究對ACI組及對照組研究對象基因分型結果顯示，2組均未發現FⅡG20210A的突變個體；ACI組患者中發現1例FⅤG1691A的雜合突變個體，也就是說FⅡG20210A及FⅤG1691A在上海漢族人群中的突變率極低。這與以往研究結果相似，Ahmed等[11]對蘇丹180名子癇前期患者及180名健康對照者進行檢測，結果未檢測到FⅡG20210A突變；同樣胡雪梅等[12]對中國維吾爾族178位深靜脈血栓患者及217位健康對照者進行檢測，也未檢測到FⅡG20210A的突變，FⅤG1691A突變率為2.18%；鄭紅等[13]對676例正常中國人及500例正常高加索人進行FⅡG20210A及FⅤG1691A變異檢測，發現FⅡG20210A及FⅤG1691A在中國變異率極低(均為為0.07%)，高加索人FⅡG20210A突變率為0.60%，FⅤG1691A為2.4%。

Isordia等[14]對墨西哥青年腦梗死患者及對照者進行分析，并未檢測出FⅤG1691A突變；Hashemi等[15]研究表明病例組FⅤG1691A雜合突變率為15.1%，對照組雜合突變率為8.3%，均未檢出純合突變型。由于FⅡG20210A及FⅤG1691A的分布差異及其在中國地區的低突變率，仍不能確定它們與腦梗死的關系，但是國外較多研究表明兩者與ACI之間存在聯系，Coen等[16]研究表明FⅡG20210A與FⅤG1691A基因多態性與ACI風險增加相關；Theythey等[17]也發現FⅡG20210A與LAA相關；Gawish等[18]對沙特阿拉伯72名腦動脈血栓新生兒和70名無血栓栓塞家族史的健康新生兒進行研究，發現FⅡG20210A和FⅤG1691A基因突變可能是沙特新生兒及兒童中風的重要危險因素。

蛋白C系統是人體的抗凝系統之一，它包括蛋白C、蛋白S、內皮細胞蛋白C受體、凝血酶調節蛋白(TM)和FⅤ組成[19]。蛋白C可滅活FⅤa而達到抗凝的作用，APCR是指在某些作用下蛋白C對FⅤa的滅活作用減弱，使機體處于高凝狀態，可能與腦梗死相關[7]。本研究對照組健康者APCR陽性率(4.67%)明顯低于ACI組(17.22%，P<0.05)，與國內其他相關研究相似。研究發現，健康人群的APCR陽性率為3%～7%，但在血栓相關性疾病中高達19%～60%[20-21]。研究發現[22]，年輕腦梗死患者(<45歲)約47%存在凝血問題，其中包括APCR、高心磷脂抗體等。本研究中腦梗死組APCR陽性率明顯高于對照組，且Logistics回歸分析也顯示APCR是ACI的獨立危險因素(OR=1.250，P=0.013)。

FⅦ基因含有8個內含子和9個外顯子，FⅦR353Q突變是指第8位外顯子的1個堿基突變，使第353位氨基酸密碼子由G變為A，導致氨基酸由精氨酸變成谷氨酰胺[6]。血漿FⅦ水平受遺傳與環境的雙重影響[23]。研究表明，FⅦ基因型對活化FⅦ(activated coagulation factor,FⅦa)水平總變異的貢獻(30%)高于對FⅦ活性(25%)的貢獻，也就是說FⅦ基因多態性主要影響FⅦa的水平[6]；1994年已有研究表明具有高FⅦ活性的老年人更易患血管疾病[24]；動物實驗發現FⅦ水平升高的小鼠腦梗死面積更大，這也間接說明了FⅦ的升高會導致更大面積的腦梗死[25]；Olson等[26]研究也表明FⅦ是ACI的危險因素，但是也有結果相反的研究，Liu等[27]研究發現FⅦR353Q突變的個體FⅦ水平升高不明顯，且FⅦR353Q與血栓性疾病無關。

本研究發現腦梗死組及對照組FⅦR353Q基因型及等位基因頻率差異有統計學意義(P<0.05)，特別是TOAST分型中的SAO型。早期血管內皮反復受損，組織因子(tissue factor，TF)暴露于血漿，FⅦ常與TF共同作用，TF與血漿中含量極低的FⅦa結合形成復合物TF/FⅦa，而FⅦa又可正反饋活化FⅦ，在Ca2+和磷脂的參與下，激活FⅨ和FⅩ，即啟動外源性凝血途徑，最終導致纖維蛋白的產生，導致血栓性疾病的發生[28-29]。一項Mate分析研究評估了SAO與非腦梗死及其他TOAST亞型的腦梗死患者的凝血、纖溶、內皮功能障礙及炎癥標記物，發現腔隙性腦卒中患者凝血/纖溶指標明顯高于非腦卒中患者，纖維蛋白原和D-二聚體在急性和慢性SAO中均顯著低于其他類型腦梗死，SAO與非腦卒中的內皮功能障礙標志物較高，與其他ACI亞型相比，SAO患者的血管性血友病因子(von Willebrand Factor，vWF)及IL-6水平明顯降低[30]。因此，除了凝血因子多態性，纖溶系統亢進、內皮功能障礙及凝血因子在SAO中也起了重要的作用。

Logistic回歸分析顯示吸煙、高血壓、高密度脂蛋白、APCR及FⅦR353Q基因型是腦梗死的獨立危險因素，其Q等位基因可能是ACI的保護性因素，FⅡG20210A及FⅤG1691A基因型因突變例數極少未納入回歸模型。

總之，本研究驗證了FⅡG20210A及FⅤG1691A基因多態性在中國漢族地區的低分布，尚不能明確FⅡG20210A與FⅤG1691A基因多態性與ACI之間關系；FⅦR353Q與ACI相關，特別是SAO型，A等位基因可能是ACI的保護性因素，FⅦR353Q與APCR可能是腦梗死的獨立危險因素。但由于ACI是多因素疾病，且各因素之間相互作用仍未完全闡明，因此仍需更深入的基礎及臨床研究探索其發病機制。