良附滴丸抗大鼠乙醇型胃潰瘍預防作用及機制*

潘潔，李莉娜，李勇軍，曹闖，郭振虎，陸苑**

(1.貴州醫科大學 民族藥與中藥開發應用教育部工程研究中心，貴州 貴陽 550004； 2.貴州醫科大學 貴州省藥物制劑重點實驗室 & 省部共建藥用植物功效與利用國家重點實驗室，貴州 貴陽 550004； 3.貴州醫科大學 藥學院，貴州 貴陽 550004； 4.貴州黃果樹立爽藥業有限公司，貴州 貴陽 550008)

隨著生活節奏加快及飲食習慣的改變，胃潰瘍的發病率有逐年上升的趨勢，由于胃潰瘍起病緩慢、病程時間較長、難以完全治愈和復發率較高等特點，對患者的身心健康及生活質量均造成不利影響[1]。良附滴丸以良附丸(水丸)為基礎，利用現代固體分散體技術將高良姜和醋香附提取濃縮制成，主要用于治療有寒凝氣滯、脘腹脹滿、疼痛吐酸等癥狀的急慢性胃炎、胃潰瘍、胃痙攣等[2-4]。由于良附滴丸是經提取濃縮等工序處理后的產品，其物質效應基礎有別于良附丸[5]，目前有關良附滴丸抗胃潰瘍作用及其機制未見報道。本實驗旨在研究良附滴丸抗胃潰瘍的作用及可能的作用機理，為良附滴丸的臨床應用提供實驗依據。

1 材料和方法

1.1材料

1.1.1藥品及試劑 良附滴丸樣品由貴州黃果樹立爽藥業有限公司提供；超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)試劑盒(A001-3)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)試劑盒(A003-1)、一氧化氮(nitric oxide，NO)試劑盒(A012)、BCA法蛋白試劑盒(A045-4)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-alpha，TNF-α)、白細胞介素-6(interleukin-6，IL-6)、前列腺素(prostaglandin，PGE2)試劑盒均為ELISA試劑盒，購于南京建成生物工程研究所；奧美拉唑腸溶膠囊為悅康藥業集團有限公司提供，編號14370930，無水乙醇為分析純。

1.1.2儀器與設備 酶標儀(上海伯樂生命醫學產品有限公司)、CO2培養箱(美國Thermo)、METTLER AE240天平(梅特勒-脫利多儀器上海有限公司)、紫外分光光度計UV-2401PC(日本島津)、超純水機(四川沃特爾科技發展有限公司)、78DZF-6050真空干燥箱(上海博訊有限公司醫療設備廠)、IMS-20全自動雪花制冰機(常熟市雪科電器有限公司)。

1.1.3動物 SD大鼠(210～230 g)由貴州醫科大學實驗動物管理中心購進，購于遼寧長生生物技術股份有限公司，許可證號為SCXK(遼)2015-0001。大鼠在12 h光照/黑暗循環下，在環境受控條件[(22±2)℃，相對濕度(50±5)%]下自由飲水。

1.2 方法

1.2.1動物分組與給藥 SD大鼠，雌雄各半，隨機分為6組，分別為良附滴丸(低、中、高)劑量組、奧美拉唑組、模型組以及空白對照組，每組8只。低、中、高劑量組分別灌胃良附滴丸良附滴丸[劑量0.27 g/(kg·d)、0.54 g/(kg·d)、1.08 g/(kg·d)]，奧美拉唑組灌胃奧美拉唑[18 mg/(kg·d)]、模型組和空白組給予等體積生理鹽水灌胃，連續給藥5 d，每天給藥1次。第5天給藥后禁食不禁水24 h，再給藥1次，1 h后除空白對照組外各組灌胃給予無水乙醇(5 mL/kg)[6]誘導潰瘍，1 h后將大鼠處死。

1.2.2胃組織學觀察、潰瘍指數及潰瘍抑制率 各組大鼠造模后，取出胃，沿胃大彎剪開，用冰生理鹽水沖洗胃組織內容物，用濾紙將水吸干，觀察各組大鼠胃組織形態并拍照；以游標卡尺測定病灶長度和寬度，并計算潰瘍指數及潰瘍抑制率。將胃組織置于福爾馬林中固定24 h，進行組織病理切片檢測。(1)潰瘍指數的計分：Guth[7]標準稍加改良，評定損傷指數；病灶長度≤1 mm計為1分，1～3 mm計2分，2～3 mm計3分，3～4 mm計4分；如果病灶長度>4 mm，將其分成若干段，每段按上述方法記分；當病灶寬度>2 mm時，得分加倍。(2)潰瘍抑制百分率= (模型組潰瘍指數-給藥組潰瘍指數)/模型組潰瘍指數×100%，每組取平均數。胃潰瘍指數評價胃黏膜損傷的程度，潰瘍抑制百分率表示某種治療藥物對潰瘍或黏膜損傷的修復效果，抑制率越高，則說明藥物的治療效果越好。

1.2.3胃組織SOD、MDA及NO測定 將胃組織用冰生理鹽水沖洗凈內容物后，濾紙吸干表面水分，將胃平面展開，剪碎，加冰生理鹽水制成10%胃組織勻漿液，4 ℃條件下8 000 r/min離心10 min，取上清液，按照相應試劑盒方法測定胃組織SOD、MDA以及NO含量。

1.2.4胃組織PGE2、TNF-α及IL-6測定 分別取各組10%胃組織勻漿液上清液50 μL，按ELISA試劑盒方法測定PGE2、TNF-α、IL-6含量。

1.3 統計學方法

2 結果

2.1 大鼠胃組織表觀及組織學觀察

空白對照組胃組織表面光滑，無出血和糜爛情況。與空白對照組比較，模型組在給予無水乙醇誘導胃潰瘍后，胃組織表面皺縮明顯，大面積出血和糜爛嚴重，且形成了較密集的黑色條帶形潰瘍；良附滴丸低劑量組大鼠胃組織表面潰瘍和糜爛情況有輕微緩解，但仍伴有嚴重出血和輕微糜爛，良附滴丸中、高劑量組和奧美拉唑組大鼠胃組織表面各種情況均有較大改善。見圖1。正常對照組大鼠胃組織結構清晰可見，黏膜未見明顯炎細胞浸潤和特殊病變；而模型組胃組織重度水腫，黏膜系中度糜爛，重度血管擴張充血、出血，伴有少量炎細胞浸潤；給予奧美拉唑組和不同劑量的良附滴丸組大鼠胃組織上述情況均明顯改善，見圖2。

注：A為空白對照組，B為模型組，C為奧美拉唑組，D為良附滴丸低劑量組，E為良附滴丸中劑量組，F為良附滴丸高劑量組。圖1 各組大鼠胃組織表觀形態特征Fig.1 The effect of liangfu dropping pills on the morphological characteristics of rat gastric tissues

注：A為空白對照組，B為模型組，C為奧美拉唑組，D為良附滴丸低劑量組，E為良附滴丸中劑量組，F為良附滴丸高劑量組。圖2 各組大鼠胃組織組織形態(HE，×200)Fig.2 The effect of liangfu dropping pills on histopathology of gastric tissues(HE，×200)

2.2 胃潰瘍指數、潰瘍抑制百分率

與空白對照組比較，模型組的潰瘍指數增大(P<0.05)，表明無水乙醇誘導胃潰瘍模型建立成功。與模型組比較，良附滴丸高、中劑量組和奧美拉唑潰瘍指數降低(P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠胃潰瘍指數及潰瘍抑制百分率Tab.1 The effect of liangfu dropping pills on gastric ulcer indexes and ulcer inhibition percentages

2.3 胃組織中SOD活力及MDA、NO水平

與模型組比較，良附滴丸低、中、高劑量組和奧美拉唑組大鼠胃組織SOD活力以及NO含量升高(P<0.05或P<0.01)，其中良附滴丸中、高劑量組效果較明顯(P<0.01)；良附滴丸中、高劑量組和奧美拉唑組MDA含量降低(P<0.05)，而良附滴丸低劑量組MDA含量與模型組比較，差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 各組大鼠胃組織中SOD活力及MDA、NO水平Tab.2 The effect of liangfu dropping pills on SOD activity, the levels of MDA and NO

2.4 胃組織勻漿中TNF-α、PEG2及IL-6水平

與模型組比較，良附滴丸組低、中、高劑量及奧美拉唑組大鼠胃組織勻漿中TNF-α、IL-6含量均降低(P<0.05或P<0.01)；良附滴丸中、高劑量組和奧美拉唑組PGE2含量明顯升高(P<0.01)，而良附滴丸低劑量組PGE2含量與模型組比較，差異無統計學意義(P>0.05)。見表3。

3 討論

胃潰瘍是一種臨床常見多發病，位于賁門和幽門之間，胃腔內消化物質對胃黏膜進行自身消化和侵蝕，導致胃黏膜的攻擊因子和防御因子不平衡，使得胃黏膜攻擊因子的增強和防御因子的減弱都會引起胃黏膜的損傷[8-9]。患者常表現出一定程度的胃脘痛、噯氣、反酸、惡心嘔吐等癥狀，嚴重者可出現嘔血、休克[10]。由于胃潰瘍典型的臨床癥狀表現為上腹部及胃脘部劍突下近心窩處疼痛，故傳統醫學根據其病癥將其歸類于 “胃脘痛”、“腹痛”、 “心痛”或者“痞滿”等疾病領域[11]。

表3 各組大鼠胃組織勻漿中PEG2、TNF-α及IL-6水平Tab.3 The effect of Liangfu dropping pills on PEG2, TNF-α and IL-6 in gastric

藥理學研究表明，胃黏膜除了易遭到H+攻擊(酸腐蝕)外，活性氧ROS在代謝過程中對胃黏膜亦發揮了重要的損傷作用，是破壞胃黏膜防御功能、導致潰瘍形成的重要因素[12]。而胃黏膜屏障對保持胃黏膜完整和不受損傷具有重要作用，能防止胃腔內的H+向黏膜內擴散，合成并釋放前列腺素，從而保護胃黏膜，其主要的代謝途徑為：在SOD催化下生成H2O2，再進一步被谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px) 或過氧化氫酶(CAT)氧化成H2O和CO2，因此，胃黏膜損傷加重與SOD活性降低有關[12-13]。SOD活性可直接反映機體清除ROS的能力，也體現了機體抗氧化保護系統的功能；ROS可以攻擊生物膜中的多不飽和脂肪酸，產生脂質過氧化的產物MDA，故MDA含量可間接反映機體受自由基攻擊的嚴重程度[14-15]。NO作為一種內源性血管舒張因子，能調節胃酸和胃黏液分泌及碳酸氫鹽生成，可有效舒張血管，增加胃黏膜血流量，從而在維持黏膜完整性和黏膜防御中直接發揮作用[16-17]。TNF-α是一種重要的致炎因子，能促進T細胞產生各種炎癥因子(IL-6、TNF- α、PGs等)相繼釋放，誘導中性粒細胞活化，釋放過氧化物酶，造成胃黏膜內皮細胞的損傷，使血流減少，影響胃黏膜血氧供給，加劇損傷，進而促進炎癥反應的生成[17-19]。PGE2是胃黏膜極為重要的防御因子，主要生理作用是抑制胃酸分泌，抑制胃液中蛋白水解酶的活性，增加碳酸氫鹽和胃酸的分泌，增強胃黏膜血流，保持黏膜血管結構完整性，改善黏膜血液循環，從而保護胃黏膜；此外，PGE2能夠調節TNF-α合成和釋放，可明顯降低TNF-α的表達[16,20]。因此，良附滴丸抗無水乙醇誘導的胃潰瘍作用可能與上述胃黏膜保護因子和炎癥介質的增加和減弱有關。

本實驗給藥劑量經人的臨床劑量換算而來，以人鼠換算因子6.3計，人體質量70 kg進行轉換得到良附滴丸大鼠劑量為0.27 g/kg，并經前期劑量確認發現大鼠臨床劑量具有較小程度的胃潰瘍修復作用，降低劑量時模型潰瘍無明顯好轉，因此以人臨床劑量換算到大鼠的劑量0.27 g/kg為低劑量，低劑量的2倍和4倍分別為中、高劑量。實驗結果表明良附滴丸中、高劑量對大鼠胃潰瘍具有明顯的修復治療作用。

綜上所述，良附滴丸能夠顯著抑制無水乙醇引起的急性胃黏膜損傷，良附滴丸不同劑量均能夠降低炎癥反應介質MDA、TNF-α和IL-6含量的產生；還可以增加機體NO、SOD、PGE2等胃黏膜保護因子的含量，從而增加血流量，以供給大量營養于受損部位，有效改善無水乙醇誘導的胃黏膜損傷。