橙皮素對倉鼠頸動脈粥樣硬化和脂質代謝的作用機制*

覃瑛，李曉杰，許鍵煒，馮戎，周誼霞**

(1.貴州醫科大學 護理學院，貴州 貴陽 550004； 2.貴州醫科大學 基礎醫學院，貴州 貴陽 550004； 3.貴州省人民醫院 健康管理體檢中心，貴州 貴陽 550004)

心血管疾病(cardiovascular disease，CVD)是造成我國和全球居民疾病死亡的主要原因，預計到2030年，全球CVD死亡人數將達2 500萬[1-2]。動脈粥樣硬化(atherosclerosis，As)是各類CVD共同的病理基礎。生活方式管理是預防和治療動脈粥樣硬化性疾病(atherosclerotic diseases，ASCVD)的基礎策略，能夠獲得最大化的效益成本比，主要包括健康均衡飲食、規律有氧運動、維持正常體質量等[3]，飲食攝入是ASCVD管理中的一個關鍵的可調節因素。多項研究結果顯示，植物性飲食可改善ASCVD可控的高血脂、高血壓、高血糖等危險因素，具有非常好的心血管保護效應[4-6]。因此，發掘具有調節機體脂質代謝作用的天然植物和明確其發揮作用的天然活性成分、并研究其具體的調控機制已成為近年來的研究重點和熱點。橙皮素(hesperetin，HES)是一種天然黃酮類物質，廣泛存在于蕓香科柑橘屬植物果中，研究表明HES具有抗炎、抗氧化、抗病毒及抗腫瘤等多種生物活性[7]。目前，關于HES調節血脂、對As形成的作用等相關研究僅有一些散見報道。Kim等[8-9]先后發現HES能降低高脂血癥大鼠和倉鼠模型中的血脂水平；朱小琴等[10]觀察到HES對ApoE-/-小鼠頸動脈As模型也具有降脂作用，且能改善As病變；但這些研究均未從分子水平對HES的降血脂機制進行探討，并且小鼠和大鼠脂代謝機制與人類也有一定的差別[11]。因此，HES對As的作用還有待在擬人化的As動物模型上進一步研究。本研究通過“頸動脈部分結扎加高脂飲食喂養”的方式建立擬人化倉鼠頸動脈As模型，檢測HES對倉鼠頸動脈As模型肝臟中低密度脂蛋白受體(low density lipoprotein receptor，LDLR)、3-羥基-3-甲基-戊二酰輔酶A還原酶(3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA reductase，HMGCR)及膽固醇7α-羥化酶(cholesterol 7α-hydroxylase，CYP7A1)的基因表達水平的影響，探究HES在調控脂質代謝和As形成中的作用，并從分子水平對其調控機制進行分析和闡釋，為拓寬對HES健康效益的認識和合理利用提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1主要試劑和儀器 HES為黃色粉末、純度為97%(上海麥克林生化科技有限公司，批號C10358475)，羧甲基纖維素鈉(sodium carboxymethyl cellulose，CMCNa)(北京索萊寶生物科技有限公司，批號C8620)，總膽固醇(total cholesterol，TC)、甘油三酯(triglyceride，TG)、低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein cholesterol，LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(high density lipoprotein cholesterol，HDL-C)測定試劑盒(中生北控生物科技股份有限公司，批號分別為182041、197971、191321、191271)，大鼠腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)ELISA 試劑盒、大鼠白介素-6(interleukin-6，IL-6)ELISA 試劑盒、大鼠單核細胞趨化蛋-1(monocyte chemotactic protein 1，MCP-1)ELISA 試劑盒(北京四正柏生物科技有限公司，批號均為20200110)，總RNA提取試劑、反轉錄試劑盒、熒光定量聚合酶鏈式反應(RT-qPCR)試劑盒(北京康潤誠業生物科技有限公司，批號分別為P118-05、A224-05、A305-05)；小動物手術器械(上海醫療器械有限公司)，冷凍離心機(美國Thermo Fisher公司，型號Heraeus Fresco 21)，多功能酶標儀(美國Bio-Tek公司，型號ELX800uv)，RT-qPCR儀(美國Bio-Rad公司，型號CFX96)，石蠟切片機(上海徠卡儀器有限公司，型號RM2016)，正置光學顯微鏡(日本Nikon公司，型號Nikon Eclipse E100)，組織研磨器(上海凈信實業發展有限公司，型號MY-20)。

1.1.2實驗動物與分組 SPF級倉鼠由河北醫科大學脂代謝研究室饋贈，許可證編號[SCXK(京)2012-0001]，飼養并繁殖于貴州醫科大學動物實驗中心。實驗動物給予清潔自來水和標準飼料喂養，自由進食和飲水，室內環境溫度為22～24 ℃、濕度為50%～60%，12 h明暗交替循環(7 ∶00-19 ∶00)。選取30只8周齡雄性倉鼠為研究對象，體質量102.62～128.20 g。研究方案經貴州醫科大學動物倫理委員會審核并批準，倫理審查編號1800812。按照簡單隨機化法，將30只倉鼠隨機分為正常對照組(NC組)、頸動脈As模型組(Model組)、HES低劑量組(L-HES組)、HES中劑量組(M-HES組)及HES高劑量組(H-HES組)，每組6只。

1.2 方法

1.2.1動物造模及給藥 參照文獻[12]，采用結扎左側頸總動脈部分分支加高脂飲食喂養方法建立頸動脈As模型。手術操作由固定的2人完成。所有手術器械高壓滅菌，鋪無菌臺巾；倉鼠麻醉后以仰臥位固定頭和四肢，頸部皮膚備皮與消毒。做頸部正中切口約2 cm，逐層切開，用顯微鑷鈍性分離左側頸總動脈、頸內動脈、枕動脈、頸外動脈及其分支甲狀腺上動脈；用5～0縫線結扎頸內動脈、枕動脈、頸外動脈，保留甲狀腺上動脈。小心將頸部組織復位，逐層縫合皮下組織與皮膚，用碘伏消毒皮膚手術切口；待倉鼠清醒后將其送回動物房飼養。術后1周內每日用碘伏消毒手術切口預防感染；恢復1周后，NC組繼續喂飼基礎飼料，Model組及HES各劑量組喂飼高脂飼料以建立頸動脈As模型。同時，L-HES組、M-HES組、H-HES組倉鼠分別按50、100、150 mg/kg劑量灌胃給藥[10]，1次/d、連續干預6周。NC組及Model組給予相同體積的0.5%羧甲基纖維素鈉。

1.2.2動物處理及標本收集 實驗期間密切觀察動物的精神狀態、活動、飲水飲食變化及毛發體態變化等行為學情況，每天記錄攝食量，每周定時稱取體質量。實驗第7周結束時，倉鼠過夜禁食不禁水12 h，行內眥靜脈叢采血，4 ℃溫度下4 000 r/min離心10 min，離心2次，分離血清。麻醉倉鼠后處死，行心臟灌流，取出肝臟，將肝臟剪成約100 mg的小塊投入液氮速凍后-80 ℃保存。分離左側頸總動脈，向下分離至主動脈弓處，向上至頸內頸外動脈分叉處，取出左頸總動脈，置于4% PFA中固定保存，用于病理形態學檢測。

1.2.3血脂及血清炎性因子的測定 血清TC、TG、LDL-C、HDL-C和TNF-α、IL-6及MCP-1的測定按相應的試劑盒說明書進行操作。

1.2.4頸動脈病理學觀察 將新鮮頸動脈組織迅速放入4%多聚甲醛中固定過夜，經梯度酒精脫水、二甲苯透明、浸蠟、石蠟包埋后，制作厚度為5 μm的石蠟切片。行HE染色后顯微鏡下觀察拍照、分析。

1.2.5肝臟中LDLR、HMGCR和CYP7A1 mRNA表達水平檢測 采用RT-qPCR法，稱取約100 mg肝臟組織，用TRIGene試劑提取總RNA；根據逆轉錄試劑盒說明書合成cDNA，使用SYBR green染料法進行RT-qPCR法檢測肝臟中LDLR、HMGCR和CYP7A1 mRNA表達水平，反應總體系為20 μL。以GAPDH為內參基因。5′-3′引物序列LDLR-F為TCGCTCTGGTCATCCTCCTTGTC、LDLR-R為GAGTTCGTCTTCCGTGGTCTTCTG，HMGCR-F為AATTGGAGTTGGCACCATGTCAGG、HMGCR-R為ACGAAGTAGTTGGCAAGCACAGAC，CYP7A1-F為CACTTGTTCAAGGCGGCACATAAG、CYP7A1-R為GCGTAGACGTATCAGTTCCGAGAC，GAPDH-F為AAGGCACAGTCAAGGCTGAGAATG、GAPDH-R為CTCCACAACATACTCGGCACCAG。反應條件為：UNG酶處理50 ℃ 5 min，95 ℃預變性2 min，95 ℃變性15 s、60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，40個循環。目的基因的mRNA相對表達量用2-ΔΔCt法分析。ΔCt值=Ct目的基因-CtGAPDH; ΔΔCt=ΔCt實驗組-ΔCt對照組。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 一般情況、攝食量及體質量變化

除NC組倉鼠外，其余倉鼠均成功實施手術，于術后1～2 h內逐漸蘇醒。實驗期間，NC組倉鼠精神良好、活動敏捷、毛發柔順有光澤，Model組倉鼠精神萎靡、不喜活動、毛發凌亂，與Model組相比，各HES劑量組倉鼠上述情況有一定的好轉；Model組倉鼠每天攝食量[(6.70±0.02)g]較NC組[(8.51±0.16)g]少(P<0.05)，各HES劑量組倉鼠的攝食量與Model組相近(P>0.05)。各組倉鼠基線體質量在同一水平(P>0.05)，實驗期間各組倉鼠體質量緩慢上升，但各組倉鼠最后體質量比較，差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 各組倉鼠實驗期間體質量變化Tab.1 Body weight changes of experimental

2.2 血脂水平

結果顯示，HES干預6周后，與NC組比較，Model組倉鼠血清TC、TG、LDL-C及HDL-C水平明顯升高(P<0.05)；各HES劑量組與Model組相比，血清TC、TG及LDL-C水平明顯降低(P<0.05)，HDL-C水平比較，差異無統計學意義(P>0.05)。見圖1。

注：(1)與NC組相比，P<0.05；(2)與Model組相比，P<0.05。圖1 HES對實驗倉鼠血脂水平的影響Fig.1 The effect of HES on serum lipid levels of experimental hamsters

2.3 血清炎性因子水平

結果顯示，HES干預6周后，與NC組比較，Model組倉鼠血清TNF-α、IL-6及MCP-1含量均明顯升高(P<0.05)；與Model組比較，L-HES及M-HES組倉鼠血清TNF-α、MCP-1水平明顯降低(P<0.05)，L-HES組倉鼠血清IL-6水平明顯降低(P<0.05)。見圖2。

2.4 頸總動脈HE染色

實驗結束時勁總動脈組織學結果顯示，NC組血管各層結構清晰，內膜無增厚，中膜平滑肌細胞以及彈性纖維走形規則、一致，未見明顯異常；Model組血管內膜中膜明顯增厚，管腔狹窄，內膜中膜分界欠清晰，中膜血管平滑肌細胞以及彈性纖維排列紊亂，內膜及中膜多見針空狀膽固醇結晶形成，局部可見小灶性壞死鈣化；L-HES及M-HES組血管各層結構清晰，內膜輕度增厚，管腔狹窄程度較Model組減輕，中膜血管平滑肌細胞腫脹，胞質略疏松，無明顯其他異常；H-HES組血管內膜增厚程度高于L-HES及M-HES組，但較Model組明顯減輕，管腔狹窄程度明顯輕于Model組，內膜中膜可見散在針空狀膽固醇結晶形成。見圖3。

2.5 肝臟中LDLR、HMGCR和CYP7A1 mRNA表達水平

結果顯示，與NC組比較，Model組倉鼠肝臟中LDLR和CYP7A1 mRNA表達水平降低(P<0.05)，HMGCRmRNA表達水平升高(P<0.05)；與Model組比較，L-HES組及M-HES組LDLRmRNA水平升高，差異有統計學意義(P<0.05)，各HES劑量組HMGCRmRNA降低，差異有統計學意義(P<0.05)，CYP7A1 mRNA水平升高、且L-HES組表達高于M-HES及H-HES組，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖4。

注：(1)與NC組相比，P<0.05；(2)與Model組相比，P<0.05。圖2 HES對實驗倉鼠血清炎性因子水平的影響Fig.2 The effect of HES on serum inflammatory cytokine levels of experimental hamsters

注：藍色箭頭示壞死鈣化灶，紅色箭頭示針空狀膽固醇結晶形成，黑色箭頭示平滑肌細胞腫脹、胞質疏松。圖3 各組倉鼠頸總動脈組織學表現(HE染色)Fig.3 The effect of HES on carotid arteries of experimental hamsters in each group(HE stain)

注：(1)與NC組相比，P<0.05；(2)與Model組相比，P<0.05；(3)與L-HES組相比，P<0.05圖4 HES對實驗倉鼠肝臟中LDLR、HMGCR和CYP7A1 mRNA表達水平的影響Fig.4 The effect of HES on expression levels of hepatic LDLR, HMGCR and CYP7A1 mRNA of experimental hamsters

3 討論

HES廣泛存在于柑橘屬植物果實中，來源廣泛、獲取便利，其藥用活性已吸引諸多研究者的關注。本研究通過“頸動脈部分結扎+高脂飲食喂養”的方式建立倉鼠頸動脈As模型，探討HES對As和脂質代謝的作用，結果表明HES能夠有效降低As倉鼠血清TC、TG及LDL-C水平，對HDL-C水平無明顯影響；研究還發現HES可上調高脂飲食倉鼠肝臟中脂代謝相關因子LDLR和CYP7A1的基因表達，下調HMGCR的基因表達，從基因轉錄水平闡釋了HES呈現良好降脂效應的機制；同時發現HES可通過調脂及抗炎途徑減輕As病變。

As的防治一直是醫療衛生工作中的重點，截至目前，As的發病機制尚未完全闡明。As動物模型是研究As斑塊形成及進展的分子機制的重要手段，也是評價新型抗As藥物的有力工具。倉鼠的脂代謝機制與人類非常接近，包括高表達膽固醇酯轉運蛋白、在小腸而非肝臟編輯腸載脂蛋白B、以低密度脂蛋白為主的血漿脂蛋白譜、低密度脂蛋白受體基因與人類的同源性高、As斑塊形成機制及病理特征與人類相似等[13]，此外倉鼠還具有繁殖速度快、抵抗力強、方便操作的特點，在脂代謝紊亂的相關疾病研究上極具優勢。本研究結果顯示倉鼠經高脂飲食喂飼6周后，其TC、TG、LDL-C和HDL-C水平明顯上升，與研究報道的人類攝入高脂飲食后血脂的變化情況一致[14]，充分說明倉鼠對高脂飲食高度易感且與人類相似。因此，本研究選擇倉鼠作為As模式動物有充分的理論依據支撐，為保證研究結論的可靠性奠定了基礎。近年來越來越多的研究運用復合因素造模法建立頸動脈As模型[15-16]。本研究嘗試以頸動脈部分結扎加高脂飲食喂養的方式建立擬人化的倉鼠頸動脈As模型，HE染色結果顯示：Model組倉鼠頸動脈血管內膜中膜明顯增厚，管腔明顯狹窄，內膜中膜分界欠清晰，中膜血管平滑肌細胞以及彈性纖維排列紊亂，多見針空狀膽固醇結晶形成，局部可見小灶性壞死鈣化，表明成功制備了頸動脈As模型。與傳統的球囊拉傷造成的直接機械性內膜剝脫相比，頸動脈部分結扎通過引起局部血流動力學的改變，間接引起內皮細胞損傷，內膜相對完整，少見血栓發生，引起As的病理改變與人類接近[12]；同時，該方法操作簡單、可重復性高、實驗成本低、成功率高，值得推廣應用。

本研究結果表明HES能有效降低血清中TC、LDL-C及TG水平，與相關的研究結果一致[9-10]，但以往的研究未對HES調控脂質代謝的分子機制做深入探究。為了充分認識HES的降血脂效應，有必要從分子水平對其調節機制進行分析闡釋。肝臟是調節脂質代謝的中樞器官，因此，本研究進一步采用RT-qPCR技術對倉鼠肝臟中調節脂代謝關鍵的分子的基因表達進行了檢測。結果發現，HES干預可上調肝臟中LDLR、CYP7A1的基因表達水平，同時下調HMGCR的基因表達水平。LDLR是一種膜蛋白，可以與血漿中的LDL特異性結合，經過細胞的內吞作用將LDL轉運至肝臟內進行降解，是清除血漿中LDL的主要途徑[17]。Bawazeer，Morin等[18-19]多個研究者均報道了在人肝癌細胞系HepG2中，HES可增加LDLRmRNA的表達。綜合體內體外研究結果可知：HES能通過上調LDLR基因表達發揮降低血漿中LDL-C的作用。HMGCR是膽固醇合成中的限速酶。Kim等[9]發現HES可抑制高膽固醇血癥倉鼠肝臟中的HMGCR酶活性，這與本研究的結果相契合，說明HES可通過抑制HMGCR基因表達，減少肝臟中膽固醇的合成，從而降低血脂水平。機體不能將膽固醇徹底分解，膽固醇在肝臟轉變為膽汁酸，隨膽汁入腸道，這是膽固醇代謝的主要去路，能夠排出體內約50%的膽固醇，CYP7A1為膽固醇轉化為膽汁酸過程中的限速酶。Ling等[20]發現柑橘皮中的總黃酮類物質可增加高脂血癥倉鼠肝臟中CYP7A1的含量，這與本研究的結果是相符的，說明HES能促進膽固醇的轉化和排泄，減少膽固醇在體內的蓄積。綜上，本課題組認為HES可參與肝臟膽固醇代謝的多條途徑，通過影響膽固醇代謝過程中的關鍵分子的基因表達，呈現良好的降血脂效應。

As是CVD的病理基礎，不穩定的As斑塊破裂、血小板聚集和血栓形成會導致血管狹窄或阻塞，從而導致急性CVD的發生。脂質浸潤和炎癥反應是As形成的2個重要環節。大量LDL在血管壁的蓄積在是引發As病變形成的始動環節，炎癥貫穿于As斑塊形成、發展、斑塊破裂、發生血栓性并發癥的全過程。TNF-α、IL-6和MCP-1是被廣泛認可的反應血管炎癥的標志物，因此，許多研究將其作為評價藥物發揮抗炎作用的觀測指標。本研究結果顯示，HES干預能降低倉鼠血清中炎性因子TNF-α、IL-6和MCP-1的含量，表明HES具有較好的抗炎癥作用，這與研究報道的HES能抑制心肌梗死小鼠模型和糖尿病大鼠模型中的炎癥反應的研究結論相符合[21-22]。體內外研究指出：HES的抗炎作用與抑制NF-κB信號通路有關[23-24]，這也是大多數黃酮類化合物發揮抗炎效應的主要機制[25]。迄今為止，理論上As的2大治療手段分別為干預脂質代謝和炎癥反應。如前所述，本研究觀察到HES具有良好的降血脂作用和抗炎效應，提示HES具有抗As的潛力。為了明確HES對As形成的作用，本課題組采用HE染色對各組實驗倉鼠頸動脈組織的病理學形態進行了觀察，結果發現各HES劑量組倉鼠頸動脈中病理改變均得到改善，且L-HES及M-HES的改善效果更為明顯，僅有內膜輕度增厚，血管平滑肌腫脹，胞質略疏松，而無明顯其他異常，這表明HES具有較好的抗As形成的作用，驗證了之前的科學假說。綜合現有的研究報道，認為HES具有較好的心血管保護效應。

綜上所述，HES具有抗As的潛力，具有較好的抗As形成的作用，也具有較好的心血管保護效應。HES能通過調控肝臟中脂質代謝相關的關鍵因子的基因表達而發揮降血脂的作用，通過降血脂和抗炎癥效應減輕As病變，具有廣闊的應用前景。