橙皮素對高脂血癥倉鼠的降脂作用和肝脂肪變性的影響*

覃瑛，許鍵煒，李曉杰，周誼霞**，李委

(1.貴州醫科大學 護理學院，貴州 貴陽 550004； 2.貴州醫科大學 基礎醫學院，貴州 貴陽 550004； 3.畢節醫學高等?？茖W校 護理系，貴州 畢節 551700)

高脂血癥臨床上稱之為血脂異常(dyslipidemia)，是眾多心腦血管疾病、非酒精性脂肪肝、代謝性綜合征等慢性疾病的重要危險因素。2018年我國疾病控制與預防中心的調查數據顯示，我國成人血脂異?？偦疾÷矢哌_49.20%，遠高于2002年的水平，且發病年齡逐漸趨于年輕化[1]，有效管理血脂已成為醫療保健工作中的重點內容。肝臟是機體進行物質代謝的重要器官，高脂血癥可引起脂肪在肝臟中的堆積，使肝細胞發生脂肪變性、肝功能下降，嚴重者發展成脂肪肝，進一步加重脂質代謝紊亂[2]。因此，開發療效好又無明顯肝毒性的降脂天然活性物質逐漸成為近年來的研究熱點。橙皮素(hesperetin，HES)是廣泛存在于蕓香科柑橘屬植物果實中的一種天然黃酮類物質，研究表明HES具有抗炎、抗氧化、抗病毒、抗腫瘤等多種生物活性[3-4]，還有研究報道HES能降低動物模型中的血脂水平[5-6]，但HES對高脂飲食誘導的肝脂肪變性的影響目前國內外還鮮見報道。倉鼠，又稱敘利亞金黃地鼠，與常用的大小鼠相比，倉鼠的脂代謝特征與人類更為接近，是研究脂代謝紊亂性疾病的優勢動物模型[7]。本研究通過高脂飲食喂養建立擬人化倉鼠高脂血癥模型，探討HES對血脂的調節作用以及對肝脂肪變性的影響，擬為拓寬對HES健康效益的認識和合理利用提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1主要試劑和儀器 HES，黃色粉末，純度為97%，上海麥克林生化科技有限公司(批號C10358475)；羧甲基纖維素鈉(sodium carboxymethyl cellulose，CMCNa)，北京索萊寶生物科技有限公司(批號C8620)；總膽固醇(total cholesterol，TC)、甘油三酯(triglyceride，TG)、低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein cholesterol，LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(high density lipoprotein cholesterol，HDL-C)測定試劑盒，中生北控生物科技股份有限公司(批號分別為182041、197971、191321、191271)；總抗氧化能力(total antioxidant capacity，TAC)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)、谷丙轉氨酶(alanine transaminase，ALT)、谷草轉氨酶(aspartate transaminase，AST)測定試劑盒，蘇州格銳思生物科技有限公司(批號分別為G0115W、G0101W、G0109W、G0423W、G0424W)；總RNA提取試劑、反轉錄試劑盒、實時熒光定量聚合酶鏈式反應(real-time quantitative PCR，RT-qPCR)試劑盒，北京康潤誠業生物科技有限公司(批號分別為P118-05、A224-05、A305-05)。冷凍離心機，美國Thermo Fisher公司(型號Heraeus Fresco 21)；多功能酶標儀，美國Bio-Tek公司(型號ELX800uv)；實時熒光定量PCR儀，美國Bio-Rad公司(型號CFX96)；石蠟切片機，上海徠卡儀器有限公司(型號：RM2016)；正置光學顯微鏡，日本Nikon公司(型號Nikon Eclipse E100)；組織研磨器，上海凈信實業發展有限公司(型號MY-20)。

1.1.2實驗動物 SPF級倉鼠由河北醫科大學脂代謝研究室饋贈，生產許可證編號[SCXK(京)2012-0001]，飼養并繁殖于貴州醫科大學動物實驗中心[SYXK(黔)2018-0001]。實驗動物供清潔自來水和標準飼料，自由進食和飲水，室內環境溫度為22～24 ℃，濕度為50%～60%，12 h明暗交替循環(7 ∶00-19 ∶00)。選取18只8周齡雄性倉鼠為研究對象，體質量105.78～125.32 g。本研究方案已通過貴州醫科大學實驗動物倫理委員會審核并批準(倫理審查編號1800812)。本實驗嚴格遵守動物倫理學3R原則。

1.2 方法

1.2.1動物造模和分組 按照簡單隨機分組法，運用SPSSS 25.0軟件生成隨機數字，將18只8周齡雄性倉鼠隨機分為空白對照組(NC組)、高脂血癥模型組(Model組)、HES組。NC組倉鼠喂飼普通飼料，另2組喂飼高脂飼料，高脂飼料配方為1.25%膽固醇+20%豬油+78.75%基礎飼料。HES組倉鼠按100 mg/kg的劑量予HES灌胃給藥[8]，1次/d，連續干預6周。NC組及Model組給予相同體積的溶媒0.5% CMCNa灌胃處理。

1.2.2動物處理及標本收集 實驗期間將動物按組分籠飼養，每日觀察動物的精神狀態、活動情況、飲水飲食變化及毛發體態變化等行為學情況，每周一清晨定時稱取體質量。分別于實驗開始時、實驗第3周和實驗末(實驗第6周末)倉鼠禁食不禁水12 h，行內眥靜脈叢采血，4 000 r/min，4 ℃離心10 min，離心2次，分離上層血清。第6周末取血后，麻醉后處死倉鼠，行心臟灌流，取出肝臟，用濾紙吸干多余水分后迅速稱取質量。將肝臟分為2部分，一部分剪成約100 mg的小塊投入液氮速凍后-80 ℃保存，一部分置于4%多聚甲醛中固定保存，用于病理形態學檢測。

1.2.3肝臟指數的測定 分離倉鼠的肝臟后稱取質量，按公式計算肝臟指數：肝臟指數=肝臟質量/體質量×100%。

1.2.4血脂和肝臟脂質含量的測定 血清TC、TG、LDL-C、HDL-C按相應的試劑盒說明書進行檢測。-80 ℃取出肝臟組織塊，稱質量后迅速置入裝有預冷的PBS 1 mL的EP管中，用組織研磨器充分勻漿制備成肝勻漿液，采用改良的Blign & Dyer法[9]抽提出肝臟中的脂質，用TC、TG測定試劑盒測定樣品中TC、TG含量，校正稱取的肝臟質量，即得到肝臟組織中TC、TG的含量。

1.2.5肝臟組織TAC、SOD、MDA水平和肝功能指標的測定 肝臟中TAC、SOD、MDA的含量及肝功能指標ALT、AST按相應的試劑盒說明書進行測定。

1.2.6肝臟病理學觀察 將固定好的肝臟組織行石蠟包埋，制作厚度為5 μm的石蠟切片、HE染色，顯微鏡下觀察分析、拍照。

1.2.7肝臟組織固醇調節元件結合蛋白-2(sterol regulatory element binding protein-2，Srebp2)和3-羥基-3-甲基-戊二酰輔酶A還原酶(3-Hydroxy-3-Methylglutaryl-CoAReductase，HMGCR) mRNA表達 稱取約100 mg肝臟組織，用TRIGene試劑提取總RNA，根據逆轉錄試劑盒說明書合成cDNA；使用SYBR green染料法進行RT-qPCR測定肝臟中Srebp2和HMGCRmRNA表達水平，反應總體系為20 μL。以GAPDH為內參基因。引物序列：Srebf2-F為GTGGTGGCAGTGGCAGTAACG，Srebf2-R為GGCTGAACGACCGCTGTATTCC；HMGCR-F為AATTGGAGTTGGCACCATGTCAGG，HMGCR-R為ACGAAGTAGTTGGCAAGCACAGAC；GAPDH-F為AAGGCACAGTCAAGGCTGAGAATG，GAPDH-R為CTCCACAACATACTCGGCACCAG。反應條件為： UNG酶50 ℃處理5 min，95 ℃預變性2 min，95 ℃變性15 s、60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，40個循環。目的基因的mRNA相對表達量用2-△△Ct法分析，△Ct值=Ct目的基因-CtGAPDH;△△Ct=△Ct實驗組-△Ct對照組。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 一般情況、體質量及肝臟指數

NC組倉鼠實驗期間精神佳、毛色順滑有光澤、身體動作靈活機敏；Model組及HES組倉鼠實驗前期精神活動狀況良好，Model組中后期開始逐漸出現精神萎靡、毛發凌亂、食欲下降、活動遲緩且不喜活動等現象，HES組倉鼠上述情況較Model組輕。各組倉鼠基礎體質量在同一水平(P>0.05)，實驗期間倉鼠體質量均有所上升；與NC組比較，Model組倉鼠的最終體質量及肝臟指數升高，差異有統計學意義(P<0.05)；與Model組比較，HES組倉鼠的最終體質量及肝臟指數下降，差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 各組倉鼠體質量及肝臟指數變化Tab.1 Changes of weight and liver

2.2 HES對血脂水平的影響

結果顯示，實驗開始時，各組倉鼠的基礎血脂水平接近，差異無統計學意義(P>0.05)。實驗第3周和第6周時，與NC組比較，Model組倉鼠血清TC、TG、LDL-C及HDL-C水平升高，差異有統計學意義(P<0.05)；與Model組相比，HES組倉鼠血清TC、TG、LDLC水平下降、差異有統計學意義(P<0.05)，HDL-C水平比較、差異無統計學意義(P>0.05)。見圖1。

注：(1)與NC組比較，P<0.05；(2)與Model組比較，P<0.05。圖1 橙皮素對各組倉鼠血脂水平的影響Fig.1 Effect of hesperetin on serum lipids level in each group

2.3 HES對肝臟組織TC、TG水平的影響

結果顯示，實驗第6周時，與NC組比較，Model組倉鼠肝臟組織TC、TG水平升高，差異有統計學意義(P<0.05)；與Model組比較，HES組倉鼠肝臟中TC、TG水平下降差異有統計學意義(P<0.05)。見圖2。

2.4 HES對肝臟組織抗氧化酶活力及MDA含量的影響

結果顯示，實驗第6周時，與NC組比較，Model組倉鼠肝臟TAC及SOD水平下降，MDA生成量升高，差異有統計學意義(P<0.05)；與Model組比較，HES組倉鼠肝臟TAC及SOD水平上升，MDA含量下降(P<0.05)，差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。

注：(1)與NC組比較，P<0.05；(2)與Model組比較，P<0.05。圖2 橙皮素對各組倉鼠肝臟中TC、TG水平的影響Fig.2 Effect of hesperetin on TC and TG levels of hamsters' livers in each group

表2 橙皮素對各組倉鼠肝臟中抗氧化酶活性及MDA生成量的影響Tab.2 Effect of hesperetin on serum antioxidant enzyme activity and MDA level in

2.5 HES對血清ALT、AST活力的影響

結果顯示，實驗第6周時，與NC組比較，Model組倉鼠血清中ALT、AST活力升高，差異有統計學意義(P<0.05)；與Model組比較，HES組血清中ALT、AST活力下降，差異有統計學意義(P<0.05)。見表3。

2.6 肝臟病理學檢測

結果顯示，實驗第6周時，倉鼠肝臟標本大體觀察可見，NC組肝臟呈暗紅色，表面光滑，質地柔軟，邊緣銳利；Model組肝臟呈乳白色，體積明顯增大，邊緣圓鈍增厚、包膜緊張，質硬易碎，有明顯的油膩感；HES組肝臟顏色呈黃白色、表面散在點狀褐色，油膩感較Model組輕。肝臟石蠟切片HE染色可見，NC組肝細胞大小均勻，細胞質豐富、著色均勻，細胞核圓而居中，肝細胞以中央靜脈為中心呈放射狀分布，表現出完整而清晰的肝小葉結構；Model組肝細胞體積明顯增大且大小不一，細胞質內出現大小不等的圓形空泡甚至融合成片，細胞核固縮深染、受到擠壓而變形甚至消失，肝索排列紊亂，表現出典型的脂肪肝病變；與Model相比，HES組肝臟脂肪變性程度有所改善，肝細胞體積腫脹減輕，脂質空泡數量減少，可見較為明顯的肝小葉結構。見圖3。

表3 橙皮素對實驗倉鼠血清中AST、ALT活力的影響Tab.3 Effect of hesperetin on serum AST and ALT level in each

2.7 HES對肝臟組織Srebp2和HMGCR mRNA表達水平的影響

結果顯示，實驗第6周時，與NC組比較，Model組倉鼠肝臟組織中Srebp2和HMGCRmRNA表達水平升高，差異有統計學意義(P<0.05)；與Model組比較，HES組肝臟組織中Srebp2和HMGCRmRNA表達水平下降，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖4。

圖3 各組倉鼠肝組織學表現(HE)Fig.3 Histological expression of livers in each group(HE)

注：(1)與NC組比較，P<0.05；(2)與Model組比較，P<0.05。圖4 橙皮素對各組鼠肝臟中Srebp2和HMGCR mRNA表達的影響Fig.4 Effect of hesperetin on hepatic Srebp2 andHMGCR mRNA expression in each group

3 討論

HES廣泛存在于柑橘屬植物果實中，來源廣泛、獲取便利，其藥用活性已吸引諸多研究者的關注。本研究通過建立擬人化高脂血癥倉鼠模型探討HES對血脂和肝脂肪變性的作用，結果表明HES能夠抑制高脂飲食誘導的倉鼠體質量增長，可通過下調高脂血癥倉鼠肝臟中脂代謝相關因子Srebp2和HMCGR的基因表達，從而發揮降血脂和減少肝臟中脂質蓄積的作用，另外還能提高肝臟中抗氧化酶活性，并改善高脂飲食誘導的肝脂肪變性，發揮良好的護肝作用。

目前，高脂血癥的防治已成為全世界醫務及科研工作者的迫切任務。建立快速有效的高脂血癥動物模型是深入研究其發病機制，開發潛在的調脂藥物的關鍵，也是為開展后續臨床研究提供可靠的基礎實驗結論的重要保證。倉鼠的血清脂代謝譜與人類相似，倉鼠具有繁殖速度快、抵抗力強、方便操作和血容量相對豐富的特點，與其他小動物模型相比，在高脂血癥的研究上具有獨特的優勢[7]。本研究發現，倉鼠在經高脂飲食喂飼僅3周時，血清中TC、TG、LDL-C及HDL-C水平即上升，且在實驗期間表現為持續上升的趨勢，與同類研究結果一致[10-11]，表明本實驗成功建立了高脂血癥模型且對高脂飲食高度易感。有研究指出人類在攝入高脂飲食后血脂四項水平均升高[12]，說明倉鼠對高脂飲食的反應性與人類相似。許多流行病學研究已經確定血清LDL-C或TC水平的升高是動脈粥樣硬化性心血管疾病(atherosclerotic cardiovascular disease，ASCVD)發生發展的重要獨立危險因素[13]，較高的血清TG水平與ASCVD獨立相關[14]。降低血脂水平可減少ASCVD的發病風險[15]。本研究發現，HES能明顯降低血清中TC、TG及LDL-C水平，與研究者在小鼠及倉鼠模型上觀察到的結果一致[6, 16]，而對血清HDL-C水平無明顯影響，與朱小琴等[8]在ApoE-/-小鼠模型上得到的結果相反，這可能是種屬差異造成的，結果提示HES具有降低ASCVD患病風險的潛力。

肝臟指數是反映肝臟病變的簡單方便的指標。本研究結果顯示，Model組肝脂數較NC組顯著升高，提示肝臟可能發生了某種病理改變。隨后對肝臟中的脂質含量檢測結果顯示，Model組倉鼠肝臟中的脂質含量高于NC組，表明高脂飲食喂飼后引起了倉鼠肝臟中脂質的蓄積從而導致肝臟腫大，HES干預后，高脂飲食倉鼠肝臟指數及肝臟中脂質含量下降，說明HES減輕了倉鼠脂質在肝臟中的沉積。研究表明肝內膽固醇穩態的改變和游離膽固醇蓄積與非酒精性脂肪肝疾病(nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)的發病機制有關；游離膽固醇的蓄積通過破壞線粒體和內質網膜完整性，觸發線粒體氧化損傷和內質網應激，并通過促進有毒的氧固醇生成而直接損傷肝細胞，促進脂肪性肝炎和肝纖維化的發展[17-18]，NAFLD患者中肝HMGCR的表達和活性增加，且與肝組織學病變程度的嚴重性成正比[19]。Srebp2屬于轉錄因子家族成員，是HMGCR的主要轉錄激活因子。正常生理狀態下，當細胞內膽固醇水平低下時，Srebp2被激活，調節其靶基因的轉錄，參與膽固醇的合成、攝取、分泌及轉運，從而增加細胞內膽固醇的利用率，相反，細胞內膽固醇增加會抑制Srebp2的活化。盡管NAFLD患者中肝細胞內膽固醇超負荷，Srebp2仍被異常激活，NAFLD患者中Srebp2 mRNA水平較正常人提高了3倍，Srebp2轉錄活性的增強是HMGCR表達增加的主要原因[20]。因此，Srebp2的上調是肝細胞內膽固醇超負荷的關鍵環節，提示其可能有望成為治療NAFLD的新靶點。本研究結果顯示：與Model組相比，HES組倉鼠肝臟中Srebp2和HMGCRmRNA表達水平下降，說明HES可通過抑制肝臟Srebp2和HMGCR的表達，降低肝臟中內源性膽固醇的合成，減輕脂質在肝臟內的蓄積，調節血脂水平。

臨床研究表明高脂血癥患者處于氧化應激狀態[21]。氧化應激能促進和加重脂代謝紊亂性疾病如脂肪肝、動脈粥樣硬化的病理進程[22]。TAC反映了生物體內清除自由基的總能力。MDA是自由基作用于器官膜脂質發生過氧化反應后的最終分解產物，能間接反映出機體內過氧化損傷的程度。SOD是體內一種重要的抗氧化酶，能有效清除機體內超氧陰離子自由基，其活力的改變可反映機體抗自由基損傷的能力。本研究表明HES干預可提高倉鼠肝臟中SOD活性，增強倉鼠的總抗氧化能力，降低由自由基介導的氧化應激損傷，這與研究報道的HES能夠提高小鼠急性腎損傷模型中腎臟組織的抗氧化能力以及糖尿病大鼠模型睪丸組織中抗氧化酶的活性的研究結論相符[23-24]，這些研究結果說明了HES具有較好的抗氧化活性。高脂血癥被公認為脂肪肝形成的“首次打擊”，長期高脂血癥誘導的氧化應激損傷被認為是脂肪肝發展的“二次打擊”[25]。本研究觀察到HES具有較好的調脂及抗氧化作用，因此推測HES對高脂飲食誘導的肝脂肪變性具有改善作用。本研究通過HE染色觀察了各組倉鼠肝臟的病理學改變，發現高脂喂飼倉鼠發生了明顯的肝脂肪變性，在用HES干預后，倉鼠的肝臟切片中脂質空泡細胞數量和面積明顯減少，可見較為清晰的肝小葉結構，表明HES能減輕高脂飲食誘導的肝脂肪變性。血清ALT和AST活性是目前臨床上最常用的反映肝實質損害的指標[26]。正常情況下，ALT和AST主要存在于細胞內，血清中的含量很低，當某種原因使細胞通透性增高或細胞膜破壞時，ALT和AST可大量釋放入血，使血清中酶活性明顯升高，血清ALT水平與肝臟損傷程度呈正比。本研究觀察到高脂血癥倉鼠血清中ALT和AST水平較NC組升高，提示長期高脂血癥會引起肝損傷，而HES可降低血清中的ALT和AST水平，說明HES逆轉了高脂飲食誘導的肝功能損害，具有護肝作用，這與觀察到的肝臟病理學改變的結果相吻合。

綜上所述，HES能抑制高脂飲食誘導的體質量增長，有效降低血脂，減少肝臟中脂質的沉積，改善高脂血癥引起的肝脂肪變性，具有保護肝功能的作用，其護肝效應可能與其降脂和抗氧化活性有關。