一株乳酸菌的分離鑒定及其在梨汁發酵中的應用

潘勇，李建宋，李靜，廖祥儒，郝之奎*

(1.臺州職業技術學院 應用生物技術研究所，浙江 臺州 318000； 2.江南大學 生物工程學院工業生物技術教育部重點實驗室，江蘇 無錫 214122)

梨是最常見的大眾水果之一，其營養豐富，不僅可口、多汁、解渴、抗疲，還有一定的保肝、通便、防癌抗癌等功效[1-2]。我國的梨樹栽培面積和梨產量均占世界的五分之四，居世界首位，產量多年保持在1 600萬t以上。《中國統計年鑒2018》顯示，2016年我國梨產量達到1 870.4萬t，主要集中在河北、安徽、新疆、河南及遼寧等省區，其中以河北、山東及新疆為代表的白梨和安徽、河南為代表的砂梨最為有名。安徽省碭山縣是我國砂梨重要產區之一，和其他梨產區一樣，由于加工水平較低，主要以鮮銷為主，由于鮮梨上市集中特點且市場容量限制，滯銷年年頻現，豐產尤甚，發展砂梨深加工迫在眉睫[3-4]。利用現代生物技術開發鮮梨發酵飲料可有效提高梨附加值、豐富梨產品種類、提高深加工量[5]，也為砂梨產業的開發利用研究提供新的思路，具有較好的社會價值和經濟價值。

本研究從梨樹根際土壤中采集土樣，利用加入溴甲酚紫指示劑的MRS培養基篩選產酸菌株，研究了該菌株的形態學和生理生化特征并通過16 S rRNA基因序列分析鑒定了該菌株為乳酸桿菌，將篩選菌株應用于梨汁發酵，優化了梨汁發酵工藝，分析了梨汁發酵前后主要成分的變化，初步探討其在梨汁發酵飲料中的應用。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

植物根際土壤取自新疆哈密某梨園；碭山梨來源于市場新鮮采購；葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、酵母粉、胰蛋白胨、牛肉浸膏、CH3COONa、C6H14N2O7、K2HPO4、MgSO4·7H2O、MnSO4·4H2O、NaOH、HCl、吐溫80 為普通試劑；細菌基因提取試劑盒和總抗氧化能力(T-SOD)試劑盒購自南京建成生物工程研究所。

主要儀器有：旋轉式恒溫搖床，上海蘇坤實業有限公司；超凈工作臺，蘇凈集團安泰公司；立式壓力蒸汽滅菌鍋，美國ZEALWAY公司；電熱恒溫鼓風干燥箱，上海博訊實業有限公司醫療設備廠；紫外分光光度計UV-2000，美國UNICO公司；電子天平CP214，奧豪斯儀器有限公司；XP基因擴增儀，杭州博日科技有限公司；pH計STARTER3100，美國OHAUS公司；數控超聲波清洗器，昆山禾創超聲儀器有限公司；高效液相色譜儀Agilent 1260，美國安捷倫公司；高速離心噴霧干燥機GEA，Niro公司。

1.2 培養基

MRS培養基：葡萄糖20.0 g·L-1，酵母粉5.0 g·L-1，胰蛋白胨10.0 g·L-1，牛肉浸膏10.0 g·L-1，CH3COONa 5.0 g·L-1，C6H14N2O72.0 g·L-1，K2HPO42.0 g·L-1，MgSO4·7H2O 0.58 g·L-1，MnSO4·4H2O 0.25 g·L-1，吐溫80 1 mL·L-1，pH 6.2～6.6。MRS培養基中添加1.5%的瓊脂粉為固體培養基。

PY基礎培養基：胰蛋白胨5.0 g·L-1，酵母提取物10.0 g·L-1，酪蛋白水解物5.0 g·L-1，鹽溶液40.0 mL·L-1。其中鹽溶液成分為：NaCl 2.0 g·L-1，無水CaCl20.2 g·L-1，MgSO4·7H2O 0.48 g·L-1，K2HPO41.0 g·L-1，NaHCO310.0 g·L-1。

碳水化合物基礎培養基：酵母粉2.5 g·L-1，胰蛋白胨 10.0 g·L-1，吐溫80 0.1 mL·L-1，1.6%的溴甲酚紫乙醇溶液1.0 mL·L-1，碳水化合物溶液 50.0 mL·L-1。其中碳水化合物溶液分別取D-果糖、D-木糖、D-甘露糖、D-半乳糖、麥芽糖、乳糖、蔗糖、纖維二糖、L-鼠李糖、海藻糖、L-山梨糖、D-甘露醇、D-山梨醇、D-阿拉伯糖、棉子糖、肌酸、肌醇等各10 g溶于1 L水中，調pH至 6.5。

檸檬酸鹽培養基(g/L或mL/L)：脫脂奶粉10.0 g·L-1，酪蛋白水解物2.5 g·L-1，葡萄糖5.0 g·L-1，瓊脂15.0 g·L-1，溶液A 10.0 mL·L-1，溶液B 10.0 mL·L-1，pH 6.5，108 ℃滅菌12 min后冷卻至45 ℃，然后加入溶液A和溶液B，混合均勻后倒平板，30 ℃避光干燥24 h備用。其中溶液A的配制方法如下：取10.0 g高鐵氰化鉀溶于100 mL去離子水中，100 ℃蒸汽加熱滅菌30 min；溶液B的配制方法如下：分別取1.0 g檸檬酸鐵和1.0 g檸檬酸鈉共溶于40 mL去離子水中，100 ℃蒸汽加熱滅菌30 min。

1.3 實驗方法

1.3.1 菌株篩選

采用稀釋涂布法處理富集培養液，30 ℃恒溫箱倒置培養，至菌落長出；挑選變黃的菌落，劃線分離直至獲純培養物。

1.3.2 菌株鑒定

觀察30 ℃條件下培養24 h后的MRS固體培養基上菌落特征。革蘭氏染色法染色待測菌，顯微鏡下觀察研究形態學特征。依據《伯杰細菌鑒定手冊》和文獻[6-8]研究待測菌的過氧化氫接觸酶實驗、精氨酸水解實驗、糖利用實驗、檸檬酸鈉利用實驗、耐酒精實驗、耐鹽實驗、產酸產氣實驗及七葉苷水解實驗等生理生化特性。

利用細菌通用引物27F(5′-AGAGTTTGATCCT GGCTCAG-3′)和1492R (5′-TACGGCTACCTTGTT ACGACTT-3′)擴增細菌16S rRNA基因。在50 μL反應體系中加入DNA模板1 μL，27F引物1 μL，1492R引物1 μL，2×EasyTaqPCR SuperMix 25 μL，加水22 μL。PCR條件如下：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1.5 min，35次循環；72 ℃延伸10 min；3%瓊脂糖電泳檢測，PCR擴增產物送到華大基因科技股份有限公司測序。

利用BLAST通過數據庫http://blast.ncbi. nlm.nih.gov分析，構建系統進化樹，找出與數據庫同源性最高的已知菌種，推測菌株可能的屬或種。

1.3.3 菌株生長特性研究

最適生長溫度：利用MRS培養基研究20、25、30、35、40 ℃條件下溫度因素對待測菌的影響，接種量為5%，60 r·min-1搖床培養24 h，測定D600值。

最適生長pH：利用MRS培養基研究pH值對待測菌生長的影響，pH值分別為4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0，接種量為5%，60 r·min-1搖床培養24 h，測定D600值。

生長曲線和產酸能力的測定：按接種量5%接種于MRS培養基中，30 ℃培養，搖床轉速60 r·min-1，每2 h測定D值，根據文獻[9]測定菌株產酸能力。

1.3.4 菌株在梨汁發酵飲料中的應用

發酵劑的制備：分別按4∶1、3∶2、2∶3、1∶4配制MRS/梨汁混合培養基，按接種量5%接種，在30 ℃，60 r·min-1條件下培養24 h，確認生長狀況較好后，轉接至含1%蜂蜜的梨汁中30 ℃發酵24 h得到梨汁的發酵劑。

待測菌發酵梨汁工藝流程：新鮮碭山梨去皮→粉碎打漿→護色(0.2%檸檬酸水)→過濾→滅菌(95 ℃，5 min)→冷卻→接入發酵劑(接種量5%)→發酵(30 ℃，24 h，初始pH 6.5)→調配(蔗糖8%)→成品。

發酵工藝條件的優化：根據上述實驗結果確定溫度，依據發酵梨汁工藝流程，其他條件不變，分別以接種量(1%、3%、5%、7%、9%、11%)、培養時間(10、20、30、40、50、60 h)、蔗糖添加量(2%、4%、6%、8%、10%、12%)進行單因素實驗，以感官評分為指標對各樣本進行評價。

以接種量、發酵時間和蔗糖添加量為三因素，以感官評分為指標，作L9(33)正交實驗。1～3水平，接種量分別為4%、5%和6%，培養時間分別為15、20和25 h，蔗糖添加量分別為5%、6%和7%。

依據國標等相關方法，隨機挑選20位感官評價經驗豐富人員參照標準對樣品進行感官評定，每組數據去除一個最高分和一個最低分后取平均值作為該項目分值。感官評分標準：色澤0～20分，鮮明柔和，有光澤，無雜色，均勻一致；氣味0～30分，有清新的梨香和乳酸味，無異味；滋味0～30分，酸甜適口，口感細膩，無不良氣味；組織狀態0～20分，流動性好，均勻不分層，微混濁，無雜質。

1.3.5 梨汁發酵前后主要成分的變化

氨基酸含量的測定：在最優發酵工藝條件下發酵梨汁，采用高效液相色譜法[10-11]測定發酵前后梨汁中總氨基酸、必需氨基酸及蘋果酸、乳酸、乙酸、檸檬酸等有機酸含量。

T-SOD、黃酮及VC含量的測定：發酵前后分別取樣，制成10%的勻漿液，離心10 min(4 000 r·min-1)，取上清液分別根據試劑盒說明測T-SOD，依據GB/T 12143附錄G測黃酮含量，采用紫外分光光度法[12]測VC含量。樣本數量為3，取平均值作為檢測結果。

2 結果與分析

2.1 菌株鑒定

2.1.1 菌株形態特征

篩選獲得的純培養菌落直徑約3 mm，淺黃色，球形，中凸起，表面光滑，成對或鏈狀排列，革蘭氏陽性(圖1)。

圖1 菌株SYBC psL4菌落特征(左)和革蘭氏染色照片(右)

2.1.2 菌株SYBC psL4生理生化特性

生理生化特性研究結果見表1，參照《伯杰細菌鑒定手冊》，初步鑒定該純培養物屬于明串珠菌屬，命名為SYBC psL4。

表1 菌株生理生化特性

2.1.3 菌株SYBC psL4 16S rRNA基因分析

PCR擴增純培養基因組，產物凝膠電泳如圖2，片段長度1 500 bp左右，無明顯拖尾。測序后通過BLAST，與Leuconostocfallax16S rRNA基因序列同源性達100%。結合生理生化研究結果，確定該純培養為欺詐明串珠菌，命名為LeuconostocfallaxSYBC psL4。

圖2 菌株SYBC psL4 16S rRNA片段PCR擴增產物凝膠電泳

2.2 菌株SYBC psL4生長特性研究

2.2.1 菌株SYBC psL4的最適生長溫度、最適pH

最適溫度和最適pH研究結果分別是30 ℃和6.5(圖3)。

圖3 溫度和初始pH對SYBC psL4生長的影響

2.2.2 SYBC psL4生長曲線和產酸能力的測定

如圖4所示，SYBC psL4的停滯期在0～4 h，對數生長期在4～12 h，此階段D值最高達到2.1，12 h后進入穩定期。SYBC psL4有較強的產酸能力，發酵12 h，pH值由6.5降至4.1，對數期產酸較多。

圖4 菌株SYBC psL4的生長曲線和產酸能力

2.3 菌株SYBC psL4在梨汁發酵飲料中的應用

2.3.1 發酵工藝條件的優化

由圖5可知，適當提高接種量可縮短延滯期，縮短發酵周期，感官評分隨著接種量的增大呈現出先增高后降低的趨勢。接種量為5%時，感官評分為87分，為最高值，接種量5.5%理論值最好。以4%、5%和6%的接種量作為正交實驗的3個水平。培養時間在10～20 h時，發酵時間對發酵梨汁的感官影響較大，發酵20 h，感官評分達88分最高值，理論預測最好時間為22 h。隨后，口感隨酸度增加而下降。選擇發酵時間15、20和25 h為正交實驗的3個水平。添加蔗糖過少或過多會使梨汁偏酸或偏甜，影響梨汁飲料的酸甜感，感官隨著蔗糖添加量增加得分先增后降，添加量為6%時得分最高。選擇5%、6%和7%的蔗糖添加量為正交實驗的3個水平。

圖5 接種量、培養時間和蔗糖添加量對梨汁發酵的影響

正交實驗結果如表2所示，發酵時間因素對感官影響最大，蔗糖添加量和接種量影響次之，最佳培養條件為發酵時間為25 h，蔗糖添加量為6%，接種量為5%。驗證實驗感官評分獲92分。

表2 各因素組合對感官評分的影響

2.3.2 發酵前后主要指標的變化

由表3可知，總氨基酸含量在發酵后變化不明顯，蘇氨酸、纈氨酸、苯丙氨酸、異亮氨酸、亮氨酸(Leu)和賴氨酸發酵后含量稍增，甲硫氨酸含量比發酵前降低明顯。

表3 梨汁發酵前后7種必需氨基酸變化

采用高效液相色譜測定了梨汁發酵前后的4種有機酸含量變化，結果顯示發酵前后，梨汁的蘋果酸和檸檬酸含量沒有明顯的減少，這與菌種不能代謝檸檬酸和蘋果酸的生化特性保持一致，發酵產生了微量的乙酸，而乳酸含量在發酵后有明顯的增加，說明發酵過程產生了大量的乳酸(圖6)。

圖6 發酵前后梨汁中有機酸含量變化

如表4所示，發酵后，T-SOD增加0.91%，無顯著變化。黃酮含量增加29.83%，增加顯著，VC的含量減少16.13%，可能發酵過程中代謝產生的乳酸，降低了pH值，保護了VC免受被氧化、分解[13]，部分VC作為底物被SYBC psL4發酵利用，轉化為有機酸或其他維生素。

表4 梨汁飲料發酵前后成分變化

3 小結

對未知菌株進行鑒定至少同時用3種方法得到相同結論才可靠，本研究對利用稀釋涂布平板法從梨根際土壤樣本中分離獲得的純培養進行了形態學、生理生化和分子生物學研究，鑒定為一株欺詐明串珠菌，命名為LeuconostocfallaxSYBC psL4。欺詐明串珠菌可用于食品加工，本研究嘗試利用該菌發酵了碭山梨汁，結果表明，發酵梨汁可獲得較好口感的發酵產物，且對主要營養成分如氨基酸和T-SOD影響不大，對VC含量影響也有限，但是，通過發酵，乳酸和總黃酮含量顯著增加，總體上看，通過發酵，較好改善了梨汁的營養結構，有一定的價值。和其他果品一樣，梨上市集中，市場易滯銷，梨的深加工水平和加工量亟待提高，目前，梨的加工形式主要是梨罐頭和少量梨汁，梨發酵飲品較少，利用包括現代生物技術在內的科技發展成果提升梨深加工技術水平是實現梨產業快速發展的重要途徑之一。