Zn-MT對運動大鼠心肌抗氧化酶及細胞凋亡蛋白表達量的影響

李 峰

Zn-MT對運動大鼠心肌抗氧化酶及細胞凋亡蛋白表達量的影響

李 峰

西安建筑科技大學體育學院，陜西 西安，710055。

目的：探討鋅-金屬硫蛋白（Zn-MT）對力竭運動大鼠（♂）心肌細胞抗氧化酶、細胞凋亡率及Bax和Bcl-2蛋白表達量的影響。方法：選取雄性SD大鼠24只，隨機分為運動對照組（A）、補充Zn-MT +運動組（B），兩組大鼠均進行跑臺運動。于力竭運動后即刻取材，抗氧化酶采用比色法，心肌凋亡細胞檢測采用TUNEL法，Bcl-2、Bax蛋白表達檢測采用免疫組化法。結果：C組和B組相比，C組GSH-Px、CAT、GSH、SOD活性有不同程度的升高；可以明顯降低心肌細胞凋亡率和Bax蛋白表達率，Bcl-2表達明顯增高。結論：補充Zn-MT可以MT可以提高心肌抗氧化酶活性，通過影響心肌細胞中Bcl-2和Bax蛋白表達，減少力竭運動后的心肌細胞凋亡。

鋅-金屬硫蛋白；抗氧化酶；力竭；心肌凋亡；Bcl-2蛋白；Bax蛋白

研究運動與抗氧化酶、細胞凋亡的關系的研究是探討運動疲勞機制的重要內容之一[1]，研究心肌缺血、過度訓練可以通過降低抗氧化酶活性來提高心肌細胞的凋亡率[2,3]，Bcl-2、Bax作為細胞凋亡的調控基因蛋白，其表達量在細胞凋亡中起著重要作用[4]。Zn-MT在生物體內廣泛存在，是一種低分子量、能被金屬誘導且富含半胱氨酸的非酶類金屬結合蛋白[5]，如何將Zn-MT與運動醫學的研究結合起來是目前研究的一個重點[6]。本實驗通過運動大鼠跑臺訓練，研究Zn-MT對力竭運動大鼠心臟抗氧化酶活性以及Bax和Bcl-2蛋白表達的影響并探討其可能機制，為運動補劑的開發提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗研究對象

Sprague-Dawley（SD）雄性大鼠24只，體重250-280g，購于陜西中醫研究所實驗動物飼養中心，國家標準嚙齒類動物干燥飼料喂養，自由飲食，動物室溫度25℃±5℃，相對濕度40%-70%，照明隨同自然變化。

1.2 動物分組與訓練方案

實驗動物適應性飼養7d后，隨機分為運動對照組（A）、補充Zn-MT+運動組（B），每組12只。大鼠自由飲食、攝水；B、C組以15m/min，15min/d運動量對動物進行為期3d的適應性跑臺訓練后，進行正式的一次性力竭跑臺訓練。具體訓練方案按照表1進行。力竭判定標準[7]：大鼠在既定強度的訓練時跟不上預定速度，運動遲緩、臀部壓跑道后壁，兩后肢失去主動性運動后拖達30s，利用毛刷刺激驅趕時無明顯反應；大鼠外在行為表現為呼吸急促、胸腹部起伏幅度大，外觀精神倦怠，俯臥位垂頭。大鼠訓練方案見表1。

表1 訓練小鼠運動項目

1.3 取材及樣品制備

組織勻漿液制備：在最后一次運動力竭后斷頭處死，立即取出心臟，用濾紙吸干，稱取適量組織加入0.9%的生理鹽水，按W（g）：V（ml）=1:9的比例加取預冷的勻漿介質（介質配比：pH7.4的0.01mol/L Tris-HCL，0.0001 mol/L EDTA-2Na，0.01 mol/L蔗糖，0.8%的NaCl溶液）于燒杯中，用眼科小剪盡快剪碎組織塊（以上全部操作在冰水浴中進行）。然后根據劑盒說明分別于低溫冷凍離心機1000 rpm/ min離心5min或3000-4000 rpm / min離心l 0min，分離上清液，4℃冰箱保存備用。使用前制備10%的勻漿液，離心（3500rpm，15min，0～4℃），取上清液在1～4℃的冰箱保存待測。

切片制備：將摘取的心臟在冰冷的生理鹽水中漂洗干凈，濾紙吸干水分并稱重。中性甲醛后固定，全自動組織脫水機進行脫水，全自動組織包埋機包埋。置入4℃的4%多聚甲醛中固定，24 h后常規石蠟包埋明、切片（厚5μm）、脫蠟水化后待測。

1.4 凋亡細胞原位標記與半定量分析

心肌組織的處理首先采用石蠟包埋，然后采用末端脫氧核苷酸轉移酶介導的脫氧尿苷三磷酸末端標記法（TUNEL）對細胞核中DNA3’-OH末端凋亡標記，最后經脫蠟、洗脫、孵育、和3，3’-二氨基聯苯胺（3，3’-diaminobenzidine，DAB）顯色，在光學顯微鏡下觀察[8]。通過對每張切片拍攝5個陽性視野，再通過每個視野中的300個心肌細胞中計數陽性細胞數，用平均數計算陽性細胞所占的百分比，從而觀察結果凋亡陽性細胞分布情況。TUNEL購自Roce公司，其他試劑均為國產分析純試劑。

1.5 Bax、Bcl-2蛋白免疫組織化學法檢測

制作心肌組織切片，使用3 %的雙氧水對內源性酶進行消除，然后再用微波抗原修復15min，隨后用1:5的小牛血清封閉抗原10min。在濕盒加入一抗后4℃下孵育過夜，然后再加入由生物素標記的二抗。通過復溫，PBS沖洗后滴加二抗，再經DAB顯色（黃），蘇木精復染，脫水，透明，封片，用多功能真彩色病理圖像分析系統進行光密度測定。Bcl-2和Bax單克隆抗體購自美國Santa Cruz公司。

1.6 統計學處理

2 實驗結果

2.1 Zn-MT對力竭訓練大鼠心肌細胞抗氧化酶活性的影響（見表2）

表2 鋅錳對訓練小鼠心肌抗氧化酶活性的影響

注：*P<0.05

由表2可以看出，C組和B組相比，抗氧化酶活性均有不同程度的回升，其中GSH-Px和GSH有顯著性差異（P<0.05）。

2.2 Zn-MT對力竭運動大鼠心肌細胞凋亡率（%）和Bax、Bcl-2蛋白表達一覽表（見表3）

表3 鋅-MT對訓練小鼠心肌細胞凋亡、Bax、Bcl-2表達的影響

注：*P<0.05，**P<0.01

由表3可以看出，B組和A組相比，細胞凋亡率下降但無顯著性差異，Bax表達下降且有極顯著性差異（P<0.01），Bcl-2表達上升有顯著性差異（P<0.05），Bax/Bcl-2比值也有顯著性下降（P<0.05）。

3 分析與討論

3.1 Zn-MT對大鼠心肌細胞抗氧化酶活性的影響

本實驗結果表明，給運動大鼠補充Zn-MT后，心肌中GSH-Px、CAT、GSH、SOD酶活性升高，這是因為（1）鋅感應蛋白金屬反應轉錄因子1（MTF-1）和亮氨酸拉鏈蛋白上游刺激因子（USF）參與了氧化應激對金屬硫蛋白的誘導[9]。而Zn-MT的啟動子中包含金屬反應元件（MRE），MRE需要MTF-1的激活，而MTF-1又需要鋅的參與。因此，抗氧化酶中的巰基可以結合Zn-MT中的游離新Zn離子，從而使氧化酶中的的巰基減弱氧化還原反應，保護心肌細胞膜的相對完整性[10]；（2）Zn-MT不穩定的動力學特性，在機體內的生物化學反應中會釋放出游離的鋅金屬離子，而鋅離子的高親和性可以競爭性地阻斷其他金屬的催化性氧化反應，從而降低H2O2生成·OH的速率，另外，Zn還可以通過抑制鐵-氧-烯醇酸復合物的形成來防止脂質過氧化反應的啟動；（3）由于Zn-MT在體內會釋放出Zn離子，與抗氧化酶中的巰基結合，防止因自由基的破壞而使Zn-MT中的金屬與巰基配位鍵斷裂，因此Zn-MT分子中巰基數目的多少會在很大程度上影響其對自由基的抵抗能力。因此可以推測Zn-MT提高心肌中GSH-Px、CAT、GSH、SOD的酶活主要是Zn-MT在機體反應過程中釋放的Zn離子；（4）金屬硫蛋白中的Zn離子也可以通過抑制Fe離子參與氧化還原反應，從而減少抗氧化酶的消耗，最終使抗氧化酶的總量增加和抗氧化能力的提高。

3.2 補充Zn-MT對大鼠心肌細胞凋亡指數和Bcl-2、Bax蛋白表達表達量的影響

細胞凋亡（Apoptosis）指為維持機體內環境穩定，由基因控制的細胞自主的有序的死亡。在機體各器官的組織細胞中，Bcl-2、Bax作為細胞凋亡調控的典型基因，其表達量與細胞凋亡密切相關。研究表明，Bcl-2在生物體內過量表達時，會形成同源二聚體，同時通過改變線粒體對Ca2+攝取速率和總量，以及通過對線粒體通透性的調節而抑制細胞膜上脂質過氧化物的形成，從而影響細胞凋亡的過程[11]。而當Bax過量表達時，會以Bax同源二聚體的形式抑制Bcl-2的活性表達，從而使細胞凋亡的概率增加[12]。由于Bcl-2/Bax的比值與Bcl-2-Bax細胞凋亡率呈負相關，因此若Bcl-2/Bax的比值升高會降低細胞的凋亡率；反之則會促進細胞凋亡的發生。

心肌細胞屬于受植物性神經支配的不隨意肌，具有興奮收縮的能力但不具備增值能力。心肌細胞凋亡與心臟正常形態結構的保持具有重要的作用，在心臟由生理性向病理性轉變的過程中起著基礎性作用，是心肌細胞發展的生物學基礎[13]。本實驗從免疫組織化學水平檢測了Bax、Bcl-2在力竭訓練后大鼠心肌細胞的表達以及細胞凋亡率的變化。結果發現在運動對照組心肌細胞中細胞凋亡率升高，Bax的表達主要表現為上調，Bcl-2表達下調，Bax/Bcl-2的比值升高。提示在進行大強度力竭性運動后心肌細胞可能出現運動疲勞性微損傷，凋亡動態失衡。這是因為在大強度運動時，心肌處于一過性缺血狀態，這對心肌是一種逆境。研究發現，細胞凋亡的產生機制之一是由于自由基的大量生成而產生的凋亡誘導作用[14]。而超氧陰離子作為自由基的一種表現形式，可以使運動后心肌細胞的凋亡增加[15,16]。由于Bax/Bcl-2的比值更能客觀反映細胞凋亡的的情況，因此在本實驗中，運動對照組Bax/Bcl-2比值增加，說明本實驗運動方案訓練可以增加心肌細胞Bax mRNA的表達量而減少Bcl-2 mRNA的表達量。

補充Zn-MT后，Bax表達下降，Bcl-2表達上升，Bax/Bcl-2比值也有顯著性下降，說明心肌細胞的凋亡得到一定的緩解，這也說明Zn-MT在抑制細胞凋亡的過程中起著重要的緩沖作用。由于Zn-MT中含有鋅離子，而鋅是機體必需微量元素，具有促進心肌成纖維細胞合成的生物學效應。在Zn-MT與氧自由基發生拮抗反應的同時，Zn2+可以游離出來，可以在一定程度上對組織進行修復和減輕炎癥反應，從而減緩由于力竭運動造成的心肌細胞損傷，抑制細胞凋亡。由此可以判定Zn-MT對心肌的保護作用可以使心肌免受自由基的損傷。其機制可能是通過抑制脂質過氧化反應的過程，在降低氧化發生率的同時促進抗氧化酶活力的升高，使細胞內外的鈣穩態保持穩定，通過Bcl-2和Bax蛋白在心肌中的不同表達量影響心肌細胞的凋亡，從而維持心肌的正常功能。

4 結 論

大強度力竭性運動會導致心肌細胞出現微引起細胞凋亡速率的加劇。補充Zn-MT可以通過增加心肌細胞抗氧化酶活性和改變Bcl-2和Bax蛋白表達，減少力竭運動后的心肌細胞凋亡，從而減輕力竭運動導致的心肌細胞受損。

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Effects of Zn-MT on the Expression of Antioxidant Enzymes and Apoptotic Proteins in Myocardium of Exercise Rats

LI Feng

Physical Education Department, Xi'an University of Architecture and Technology, Xi' an Shaanxi, 710055, China.

Purpose: Probe into the influence of myocardium cell anti-oxidase, apoptosis、Bax、Bcl-2 about Zn-MT to exhaust mouse. Method：Choose 24 male SD big mice, assign to the sport control group（A）, supplementing Zn-MT+sport group（B）at random. B，C groups draw materials after strength exhaust sports，adopt the colorimetry to detect anti-oxidase，adopt TUNEL law to detect myocardium apoptosis、Bcl-2, adopt immune group law detect Bax albumen express. Result：In B Group, GSH-Px, CAT, GSH, SOD active decline, there is rising after supplementing Zn-MT, compared with group B, C group myocardium apoptosis and Bax protein express decrease obviously, Bcl-2 expresses increases. Conclusion: supplementing Zn-MT Can improve the myocardium anti-oxidase activity, reduce the myocardium cells after strength exhausts sports and apoptosis through influencing the myocardium.

Zinc-metallothionein; Anti-oxidase; Exhausted; Apoptosis; Bcl-2 albumen; Bax albumen

1007―6891（2020）03―0033―03

G804.7

A

2019-07-31

2019-09-03

2017年陜西省社會科學基金項目（2017R007），陜西省教育廳專項科研計劃項目（17JK04180）。