基因芯片技術在自然流產胚胎染色體分析中的應用

余勤儉，孫素玉，沈旭娜，徐雪琴，唐少華，周媛萍

(1. 溫州市中心醫院 婦產科，浙江 溫州 325000；2.湖州市婦幼保健院 婦產科，浙江 湖州313000)

造成自然流產的原因眾多，有研究[1]表明，超過50%的自然流產是由胚胎染色體異常引起。目前臨床對胚胎染色體分析的金標準為染色體核型分析技術，但染色體核型分析技術診斷周期長且易受標本陳舊、污染等多種因素影響。基因芯片單核苷酸多態性陣列(single nucleotide polymorphism array，SNP-array)是含有大量SNP位點序列的高密度基因芯片，由原位合成在硅材料上的大量特定寡聚核苷酸(探針)組成，將待測核酸樣本處理后與芯片上的探針按照堿基互補配對原則進行雜交。采用激光共聚焦掃描經染色、信號放大處理后的雜交芯片采集熒光信號，對每個點的熒光強度進行數字化分析，判斷對應片段或位點是否有擴增或缺失，可實現核酸分子高通量檢測和分析[2]。Affymetrix公司基因芯片對人類基因組的分布密度為1 marker/4 kb，芯片包含550 000 CNV標記及200 000 SNP標記。本研究采用Affymetrix公司基因芯片技術對自然流產患者胚胎組織進行全基因組染色體檢測，旨在探討該基因芯片技術在臨床染色體分析中的應用價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2015年1月—2017年6月溫州市中心醫院收治的70例早期自然流產患者為研究對象，所選患者均經B超檢測胚胎停止發育或胎心、胎芽消失。所選患者年齡21～42歲，平均(31.0±3.6) 歲；孕周7～12周，平均(9.2±0.9) 周；孕次1～3次，平均(1.7±0.6) 次。本研究經溫州市中心醫院倫理委員會批準，所有患者均簽署知情同意書。

1.2 基因芯片檢測 無菌條件下，采用DNA提取試劑盒(QIAGEN 51104 QIAamp DNA Blood Mini Kit試劑盒，美國QIAGEN公司)提取流產胚胎組織基因組DNA，按照試劑盒說明書步驟提取。采用Affymetrix公司的基因芯片(Affymertrix GeneChip 750K SNP)進行全基因組染色體檢測，操作方法：提取的基因組DNA溶解于AE 緩沖液，調整濃度至50 ng/μL，用Nsp I限制內切酶進行處理。運用T4連接酶將Nsp I接頭連接至Nsp I酶切產物上，然后以Nsp I酶切產物為模板進行PCR擴增，1份Nsp I酶切產物做4個PCR擴增反應，擴增片段為150～2 000 bp。擴增的4份PCR產物進行磁珠法混合純化后，用52 μL洗脫液進行洗脫。取2 μL進行濃度測定，45 μL加入5 μL稀釋的片段化試劑進行PCR片段化程度，片段化產物在25～125 bp內。片段化產物在脫氧核糖轉移酶的作用下進行標記反應后，置入芯片與混合純化液進行雜交變性，雜交時間為16～18 h，溫度50℃。雜交完成后將芯片進行洗滌、染色，最后進行芯片掃描。

1.3 數據分析 采用Affymetrix公司研發的染色體分析軟件進行數據分析，染色體異常包括染色體數目異常以及結構異常。數目異常主要為非整倍體以及多倍體，結構異常為染色體拷貝數目變異(CNV)，CNV判斷標準為缺失片段大于400 kb，重復片段大于1 Mb[3]。

1.4 臨床評價標準 采用美國醫學遺傳協會制定的CNV診斷專業指南[4]進行CNV結果的臨床評價。①良性CNV指在多個已有的文獻或數據庫資料中均報道為良性變異；②致病CNV指在既往相關文獻、數據庫中已經明確為致病變異；③致病意義不明CNV指在報告時無法找出明確證據來明確檢測到的CNV 的臨床意義，或所檢測到的CNV不符合報告標準。

2 結果

2.1 染色體異常情況 基因芯片技術檢測70例早期自然流產胚胎組織基因，21例正常，49例異常，異常檢出率為70.0%。49例異常中38例為染色體數目異常，11例為染色體結構異常。

2.2 染色體數目異常 38例染色體數目異常中，三倍體4例，非整倍體34例。6例染色單體(45, XO)，2例2-三體，2例3-三體，2例4-三體，1例7-三體，1例8-三體，1例15-三體，10例16-三體，1例17-三體，1例18-三體，3例21-三體，2例22-三體，1例48，XX，+7，+21，1例50，XX，+13,+18,+19,+21。

2.3 染色體結構異常 11例染色體結構異常中，1條染色體異常為微缺失或微重復有10例，染色體結構復雜異常即多條染色體結構改變1例。具體染色體核型見表1。

表1 染色體結構異常及核型

3 討論

超過35歲且有過流產史女性中，染色體異常導致流產的風險達75%以上[5-6]。本研究中70例自然流產的染色體異常率為70.0%。本研究中，染色體異常主要包括染色體多倍體、單體、三體以及染色體結構異常等，38例染色體數目異常中，三倍體4例，非整倍體34例，其中染色單體(45, XO)6例，與既往研究[7]結果相符合。11例染色體結構異常中，10例出現微缺失或微重復，1例為染色體結構復雜異常。查閱11例結構異常染色體所對應的核型，發現部分染色體拷貝數目變異與身材矮小、發育遲緩、智力障礙以及器官畸形等有關，是否與自然流產有關還需擴大樣本量進一步研究；部分染色體拷貝數目變異顯示為致病意義不明，需對其父母的染色體進行檢測，判斷是否與雙親遺傳有關[8-9]，如遺傳自父母，大部分為良性多態性改變；如為突變，可能為存在臨床意義的CNV[10-11]。

流產遺傳學檢測結果不僅可解釋該次流產的具體原因，同時可為下次妊娠提供具體建議[12-13]。如檢測結果為非整倍體，則大多為偶發性，下次妊娠選擇合適的產前診斷可獲得良好預后；若為正常染色體或染色體多態性導致的流產，則需找尋其他原因；若為致病意義不明確的染色體拷貝異常，則需檢測是否為雙親遺傳等。基因芯片技術運用于流產胚胎及胎兒染色體檢測具有如下優勢[14-15]：①分辨率高，可檢出小于5 Mb的CNV；②準確性高，可避免培養中出現染色體突變以及母體細胞選擇性生長等情況；③檢出率高；④檢測速度快。基因芯片技術也存在著不足，如基因芯片技術無法檢測染色體的插入、倒位、平衡易位以及低比例嵌合，對致病意義不明的染色體拷貝異常無法明確其臨床意義[16-17]。本研究11例染色體結構異常中，一條染色體異常為微缺失或微重復有10例，小于5 Mb的CNV有6例，最小的為1.04 Mb，優于傳統核型分析技術水平。

綜上，基因芯片技術對自然流產患者胚胎組織的全基因組染色體分析具有準確性高、檢出率高的特點，在流產病因解釋、遺傳咨詢、產前診斷、再次生育指導等方面具有臨床應用的價值。