四溴雙酚A誘導大鼠肝臟氧化損傷機制的研究

何建波, 張杭君

(杭州師范大學 生命與環境科學學院，浙江 杭州 311121)

四溴雙酚A(tetrabromobisphenol A, TBBPA)是目前使用較為廣泛的典型溴化阻燃劑，是一種持久性環境污染物[1]。近幾十年的研究[2]顯示，TBBPA已在河流、水生生物甚至人體血液中檢出。在日本大阪的水生動物中，魚類體內和貝類動物體內TBBPA的濃度分別達到0.8 μg/kg·ww和4.6 μg/kg·ww。英國海域的海豚脂肪樣品檢測結果顯示TBBPA的濃度范圍為6～35 ng/kg·ww[3]。在美國波士頓的婦女母乳樣品中，35%的樣品檢測到了TBBPA，濃度范圍為0～11 ng/g·fat[4]。挪威某一電子拆解廠電子拆解工人血漿中的TBBPA濃度要高于實驗室人員[5]。近年來，國際癌癥研究機構(IARC)對TBBPA的毒性進行了評估[6]，因具有致癌作用，TBBPA已被列入2A類致癌物。TBBPA在環境中廣泛存在，動物和人類可通過呼吸吸入、皮膚接觸和攝入等途徑接觸到TBBPA，這對環境中的動物和人類的健康造成巨大威脅[7]。

目前，大量的研究主要關注TBBPA對水生動物的影響，對哺乳動物的影響研究較少，尤其是對哺乳動物肝臟的損傷及其作用機制還尚未闡明。已有研究[8]發現，溴代阻燃劑容易在肝臟中富集。鯽魚暴露于TBBPA 12周后發現，TBBPA能夠引起鯽魚肝臟中脂質積累、肝細胞出現空泡化、細胞間隙增大等現象[9]。Wikoff等[10]認為TBBPA在魚體產生的毒性效應與氧化應激有關。TBBPA暴露可導致幼齡卿魚抗氧化系統中超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活力的降低，還原型谷胱甘肽(GSH)水平呈時間和劑量依賴性下降，造成機體氧化應激[6]。黑斑蛙暴露于TBBPA后，精巢組織出現空泡、生精細胞排列紊亂、生精細胞不同程度的分散脫落等明顯病變；同時，黑斑蛙精巢組織中的總超氧化物岐化酶(T-SOD)，GSH-PX活性降低，GSH含量明顯降低，表明TBBPA暴露擾亂了黑斑蛙抗氧化系統[11]。本文以TBBPA為目標污染物，以雄性SD大鼠為研究對象，采用體內暴露方法研究TBBPA對雄性SD大鼠肝臟損傷的效應及其作用機制，為阻燃劑的生態健康風險研究提供依據。

1 材料與方法

1.1 試驗動物 選取42只7周齡Sprague-Dawley雄性大鼠，體質量為(222.2±2.5)g，由杭州師范大學實驗動物中心提供。大鼠飼養于SPF級實驗動物飼育室：環境光照周期為12 h光照和12 h黑暗，溫度為(23±2)℃，濕度為(50±10)%，自由飲食。正式試驗前飼養1周適應新環境。所有實驗程序均按照杭州師范大學實驗動物中心實驗動物倫理規定進行。

1.2 主要試劑與儀器 TBBPA(tetrabromobisphenol A，化學式：C15H12Br4O2，純度>98%，CAS：79-94-7)標準品和玉米油(CAS：8001-30-7)購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司，活性氧(ROS)、SOD、GSH和GSH-Px檢測試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。超薄切片機(Leica EM UC7)、烘片機(Leica HI 1220)和石蠟切片機(Leica RM 2235)均購自德國徠卡公司，透射光顯微鏡(Olympus BX 51)購自日本Olympus公司，酶標儀(Thermo Fisher Multiskan FC)購自美國Thermo公司，高度冷凍離心機(KDC-140 HR)購自安徽中科中佳科學儀器有限公司。

1.3 大鼠飼養與暴露 將42只SD大鼠隨機分為4個處理組: 0、10、100、1 000 mg/kg；2個恢復組: 0(R)mg/kg(空白恢復組)、1 000(R)mg/kg(1 000 mg/kg劑量恢復組)，每組7只。給藥時，將TBBPA溶解于食用玉米油中，保存于冷藏條件下(約4℃)，每周更換1次，保證給藥溶液穩定性。每天上午9時對各組大鼠進行灌胃，對照組給予等量玉米油，連續灌胃35 d。暴露結束后，4個處理組進行解剖采樣。2個恢復組停止灌胃，正常進食，自然恢復1周后進行解剖采樣。每日準確記錄體重，觀察大鼠的生長發育情況。

1.4 大鼠肝臟組織樣品采集 最后一次灌胃24 h后稱重，4個處理組進行解剖采樣，靜脈注射0.5 mL70%乙醇使大鼠死亡后立即解剖。取出各器官組織，用濾紙吸干血水后準確稱重。2個恢復組的大鼠自然恢復1周后進行解剖采樣。肝臟系數=(肝臟質量/體質量)×100%

1.5 HE染色與觀察 取各組新鮮肝臟組織樣本1份，經中性緩沖液福爾馬林(pH 7.4)固定12～24 h，用水沖洗30 min后脫水。用75%～100%乙醇梯度脫水后，放入85%、95%及100%二甲苯中透明。經過浸蠟、包埋后進行切片。切片厚度3 μm，然后經過脫蠟、HE染色、封片后，在光學顯微鏡下觀察、拍照(×100)，分析最大截面，觀察肝臟組織形態。

1.6 活性氧與抗氧化相關指標檢測 SOD測定(羥胺法)：按試劑盒說明書應用黃嘌呤氧化酶法測定樣品中的SOD活力，用U/mg蛋白表示；ROS測定(化學熒光法)：按試劑盒說明書應用DCFH-DA法測定樣品中的ROS活性，用熒光度量/毫克蛋白表示；GSH-Px測定：按試劑盒說明書應用黃嘌呤氧化酶法測定樣品中的GSH-Px活力，用μmol/g蛋白表示；GSH測定：按試劑盒說明書應用黃嘌呤氧化酶法測定樣品中的GSH含量，用μmol/g蛋白表示。

1.7 統計學分析 采用GraphPad Prism 7.00和 SPSS 20.0軟件進行數據統計分析。計量資料2組間比較采用t檢驗，多組間比較采用方差分析，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同濃度TBBPA暴露對大鼠肝臟的影響 連續灌胃35 d后，與0 mg/kg組比較，10 mg/kg組、100 mg/kg組、1 000 mg/kg組的大鼠平均體增重均降低；其中1 000 mg/kg處理組大鼠的平均體增重[(142.7±24.8) g]比0 mg/kg組[(218.5±33.3) g]減少了34.7%，差異具有統計學意義(P<0.05)，見封三圖1A。連續灌胃35 d后，各劑量組大鼠的平均肝臟重與0 mg/kg組比較未表現出明顯差異，見封三圖2B。經過1周自然恢復后，1 000 (R) mg/kg組平均肝臟重[(13.9±1.7) g]比1 000 mg/kg組[(12.2±1.5) g]增長了13.9%，平均體增重比1 000 mg/kg組增長了29.2%。如封三圖1C所示，連續灌胃35 d后，TBBPA對大鼠的肝臟系數無統計學意義影響。

2.2 不同濃度TBBPA暴露對大鼠肝臟組織形態結構的影響 HE染色結果顯示，連續灌胃35 d后，0 mg/kg 組肝臟組織形態正常(封三圖2A)；10 mg/kg組經四溴雙酚A暴露后，肝臟細胞出現部分空泡(封三圖2B，黑色箭頭)；100 mg/kg組細胞空泡化現象明顯，并伴有細胞邊界模糊現象(封三圖2C，黑色箭頭)；1 000 mg/kg組出現空泡化現象的肝細胞數量相對較少(封三圖2D，黑色箭頭)，但細胞膜邊界模糊現象加重且細胞間隙增大。與1 000 mg/kg組比較，1 000(R)mg/kg組經1周恢復后，細胞空泡現象減少，肝細胞組織損傷有所減輕，與0(R)mg/kg組(封三圖2E)相比，1 000(R)mg/kg組仍存在一定程度的形態學變化(封三圖2F)。

2.3 不同濃度TBBPA暴露對大鼠肝臟ROS含量的影響 如圖1所示，與0 mg/kg 組ROS含量[(84.3±18.5 )熒光度量/毫克蛋白]相比，經過TBBPA暴露35 d后，10 mg/kg組[(59.5±11.5) 熒光度量/毫克蛋白]、100 mg/kg組[(47.0±7.6) 熒光度量/毫克蛋白]、1 000 mg/kg組[(46.4±7.5) 熒光度量/毫克蛋白]的大鼠肝臟中ROS含量分別降低了29.4%、44.2%、45.0%，差異均有統計學意義(P<0.05)。恢復1周后，1 000(R)mg/kg組的ROS水平[(73.2±9.2 )熒光度量/毫克蛋白]比1 000 mg/kg組升高了57.8%，差異有統計學意義(P<0.05)。

**與0 mg/kg組比較，P<0.01；##與1 000 mg/kg組比較，P<0.01。圖1 不同濃度四溴雙酚A暴露后大鼠肝臟ROS水平的變化

2.4 不同濃度TBBPA對大鼠肝臟中T-SOD的影響 如圖2所示，連續灌胃35 d后，與0 mg/kg 組相比，10 mg/kg組、100 mg/kg組T-SOD的活性升高； 1 000 mg/kg組大鼠肝臟T-SOD活性略低于10 mg/kg組和100 mg/kg組。自然恢復1周后，1 000(R)mg/kg組的T-SOD含量比1 000 mg/kg組降低12.6%，差異有統計學意義(P<0.05)。

#與1 000 mg/kg組比較，P<0.05。圖2 不同濃度四溴雙酚A暴露后大鼠肝臟T-SOD活性的變化

2.5 不同濃度TBBPA對大鼠肝臟GSH含量的影響 如圖3所示，與0 mg/kg 組相比，在TBBPA連續暴露35 d后，10 mg/kg組、100 mg/kg組、1 000 mg/kg組大鼠肝臟組織中的GSH含量隨著TBBPA濃度的上升逐漸上升；100 mg/kg組、1 000 mg/kg組的大鼠肝臟GSH含量分別比0 mg/kg 組上升了8.6%、27.3%，差異均有統計學意義(P<0.05)。1周自然恢復后，1 000(R)mg/kg組的GSH含量比1 000 mg/kg組降低了23.4%，差異有統計學意義(P<0.05)。

**與0 mg/kg組比較，P <0.01；##與1 000 mg/kg組比較，P <0.01。圖3 不同濃度四溴雙酚A暴露后大鼠肝臟GSH含量的變化

2.6 不同濃度TBBPA對大鼠肝臟中GSH-Px活性的影響 如圖4所示，與0 mg/kg 組[(73.7±17.2 )μmol/g蛋白]相比，在TBBPA連續暴露35 d后，10 mg/kg組、100 mg/kg組、1 000 mg/kg組大鼠肝臟組織中的GSH-Px活性隨著TBBPA濃度的上升逐漸上升；1 000 mg/kg組的大鼠肝臟GSH-Px活性[(106.5±12.83) μmol/g蛋白]比0 mg/kg 組上升了44.5%，差異有統計學意義(P<0.01)。1周自然恢復后，1 000(R)mg/kg組的GSH-Px活性與1 000 mg/kg組比較，差異無統計學意義(P>0.05)。

**與0 mg/kg組比較，P<0.01。圖4 不同濃度四溴雙酚A暴露后大鼠肝臟GSH-Px含量的變化

3 討論

有研究[12]證實，TBBPA對水生生物的生存、繁殖和生長發育有一定的危害。斑馬魚暴露于TBBPA會導致產卵量和幼魚存活率下降[13]。也有報道[14]稱，TBBPA會干擾斑馬魚胚胎幼體的發育。研究[15]顯示，TBBPA暴露導致斑馬魚胚胎孵化率、存活率降低，胚胎畸形率增加。也有研究[16]發現，TBBPA 會抑制蝌蚪尾巴的發育。250 μg/L TBBPA暴露可抑制黑斑蛙蝌蚪的生長發育[11]。本研究結果顯示，1 000 mg/kg TBBPA體內灌胃可導致大鼠體增重明顯下降，與正常組大鼠體增重相比降低了34.7%，對大鼠的生長發育產生抑制作用。先前的研究[17]顯示，長期低劑量暴露于雙酚A(BPA)的大鼠體質量和肝臟系數并未受到影響。100 mg/kg BPA染毒6周對大鼠體質量無明顯影響[18]，200 mg/kg劑量BPA暴露會導致大鼠體質量增長緩慢[19]，提示TBBPA對大鼠生長發育的影響要強于化學結構更簡單的BPA。

大量生態健康風險研究[20]報道，環境中廣泛存在的阻燃劑能夠對動物體造成病理性的損傷。接觸溴化阻燃劑異氰脲酸酯，能引起小鼠肝臟組織結構受損[21]。有機磷酸酯阻燃劑暴露可造成斑馬魚肝臟細胞腫脹，細胞邊界模糊等[22]。黑斑蛙接觸全氟辛酸(perfluorooctanoic acid，PFOA)會導致肝臟細胞出現邊界模糊及空泡化現象[23]。有研究[11]顯示，TBBPA可造成黑斑蛙精巢組織損傷，肝細胞出現空泡等病理學特性。TBBPA可在小鼠肝臟內蓄積，對小鼠肝臟造成潛在危害[24]。本研究結果顯示，暴露于TBBPA后，大鼠肝臟組織學出現病理性損傷，包括肝細胞腫脹、細胞空泡化及細胞膜邊界模糊等現象；隨著TBBPA暴露濃度的升高，大鼠肝臟組織損傷更為明顯。Ronn等[25]的研究結果顯示，短期高濃度(250 mg/kg)BPA暴露會造成Fischer 344大鼠肝臟氧化損傷，這與本研究結果一致，提示高濃度的阻燃劑對哺乳動物肝臟具有一定損傷作用。

細胞內ROS的穩態是機體正常代謝的保障[26]。在正常情況下，過量的ROS和其他促氧化劑可由抗氧化防御系統相關抗氧化酶分解，以維持生物體內氧化抗氧化的平衡[27]。有研究[28-29]報道，化學試劑等危險因素可能破壞細胞內氧化還原平衡，進一步造成機體損傷。研究[30]顯示，TBBPA暴露可誘導魚類抗氧化系統失衡，最終造成精子質量下降。TBBPA引起的靶器官毒性作用可能是通過誘導機體抗氧化系統紊亂造成的。機體內抗氧化系統通常會通過響應ROS的變化來調節氧化與抗氧化系統的平衡。有研究[11]顯示，黑斑蛙暴露于TBBPA后，ROS水平降低，造成黑斑蛙精巢中抗氧化系統的失衡，最終導致精細胞結構損傷。本研究結果顯示，TBBPA可造成大鼠肝臟中ROS水平異常，1 000(R)mg/kg組的ROS水平比1 000 mg/kg組升高了57.8%，與 0(R)mg/kg組水平接近；有報道[31]顯示，BPA可造成氧化系統失衡，導致大鼠肝臟組織氧化性損傷；提示TBBPA通過影響大鼠肝臟ROS水平破壞氧化還原平衡而肝臟造成氧化損傷。

SOD、GSH-Px活性與GSH含量是反應機體健康的重要指標。SOD可通過歧化反應消除超氧陰離子自由基，生成過氧化氫[32]，對機體內氧化抗氧化系統平衡起重要作用，可保護細胞免受損傷。當蚯蚓受到輕度環境脅迫時, 體內SOD酶活性會有所提高, 而當受到重度逆境脅迫時, SOD酶活性通常下降[33-34]。有研究[19]表明，隨著BPA劑量的升高，SOD水平會有一定程度的降低，可能與高劑量時GSH-Px無法代償性增加有關，這與本研究結果一致，表明在高劑量下，TBBPA可能會對大鼠體內存在的SOD酶活性產生影響，使大鼠對氧化脅迫的能力降低[35]，減弱大鼠清除氧自由基的能力。GSH可保護細胞免受氧化應激誘導的氧化損傷，提供最佳的氧化還原環境，使細胞內蛋白功能正常進行。研究[24]表明，Wistar大鼠暴露于TBBPA 28 d后，可導致大鼠GSH含量上升，產生肝毒性效應。Zieminska等[36]研究結果與本研究結果一致，TBBPA濃度與GSH呈劑量依賴效應，表明TBBPA會引起GSH水平異常。GSH-Px是機體中重要的抗氧化酶, 是自由基清除系統的重要組成成分。研究[37]表明，暴露于BPA下的大鼠GSH-Px活性升高，與本研究結果一致。本研究結果顯示，隨著TBBPA濃度的增加，抗氧化酶GSH-Px活性也隨之增加，可能導致氧化系統與抗氧化系統失衡，最終導致氧化損傷。

綜上所述，1 000 mg/kg TBBPA體內暴露可抑制SD大鼠的生長，大鼠肝臟組織出現病理學損傷。通過對肝臟中SOD、ROS、GSH和GSH-Px活性的影響，TBBPA破環大鼠肝臟中氧化還原系統的平衡，最終造成肝臟的氧化損傷效應，進而抑制其生長發育。本研究可為四溴雙酚A生態健康風險評價提供理論依據。