真核起始因子3b在乳腺癌中的表達及與患者臨床特征的關系△

李延輝，方茅，謝敏如，夏明汗

1東莞市石碣醫院病理科，廣東 東莞523290

2廣州醫學院病理教研室，廣州510000

3暨南大學附屬第一醫院病理科，廣州510000

乳腺癌的發生發展是一個復雜、多因素參與的過程，基因表達調控異常在乳腺癌的發生發展中發揮關鍵作用。既往臨床對腫瘤細胞增殖相關基因的調控主要集中在轉錄水平，事實上，翻譯過程的異常調控也與腫瘤的發生密切相關。研究顯示，在包括乳腺癌在內的多種惡性腫瘤中，參與真核生物蛋白質合成的真核起始因子（eukaryotic initiation factor，eIF）的各種亞基表達水平發生了明顯變化，其與惡性腫瘤的增殖、轉移及患者的預后密切相關[1-2]。由于 eIF3b結構的特殊性，在eIF3復合物中起腳手架的作用，目前，大量研究提示，eIF3b通過調控蛋白翻譯的過程參與細胞周期、細胞凋亡、侵襲和遷移等相關信號通路，影響腫瘤的發生發展[3-4]。但目前尚無以eIF3b為切入點揭示調控乳腺癌增殖、凋亡、侵襲和遷移的相關信號通路的研究。本研究檢測了乳腺癌組織中eIF3bmRNA和eIF3b蛋白的表達情況，分析其與乳腺癌患者臨床特征的關系，進而探討eIF3b在乳腺癌發生發展中的作用和相關機制，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2016年11月至2018年11月東莞市石碣醫院和暨南大學附屬一院收治的乳腺癌患者。納入標準：病理學診斷確診為浸潤性乳腺癌，接受根治性手術治療。排除標準：合并其他惡性腫瘤；術前接受放、化療或內分泌治療等抗腫瘤治療；臨床資料不完整。依據納入和排除標準，本研究共納入45例女性乳腺癌患者，年齡31～72歲，平均年齡為（54.6±8.5）歲。取45例乳腺癌患者手術切除的乳腺癌組織和相應的癌旁組織，癌旁組織取自距乳腺癌邊緣約2 cm的組織，均經病理檢查診斷為正常乳腺組織。

1.2 實驗方法

1.2.1 主要試劑和儀器 互補DNA（complementary DNA，cDNA）逆轉錄試劑盒、逆轉錄聚合酶鏈反應（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）試劑盒均購自美國Invitrogen公司，兔抗人eIF3b多克隆抗體購自美國Abeam公司，二步法檢測試劑盒購自北京中杉金橋生物技術有限公司，eIF3b、β-actin引物均由中國上海博尚生物有限公司合成。

1.2.2 實時定量RT-PCR法檢測eIF 3 bmRNA的相對表達量 取乳腺癌組織及相應癌旁組織標本，按照操作說明提取總RNA，加入100 μl裂解液研磨成勻漿狀，置入1.5 ml離心管中12 000 r/min，離心 15 min，以 Trizol法抽提總 RNA。以 1 μg 的RNA為模板，按照RT-PCR逆轉試劑盒操作說明書進行逆轉錄反應。以β-actin為內參，擴增條件：94℃ 5 min，94℃ 30s、57℃ 30s、72℃ 30s共45個循環。采用實時定量PCR法計算eIF3bmiRNA的相對表達量。eIF3b上游引物：5'-CGGTGCCTTAGCGTTTGTG-3'，下游引物：5'-CGGTCCTTGTTGTTCTTCTGC-3'；β-actin上游引物：5'-TGACTTCAACAGCGACACCCA-3'，下游引物：5'-AGGGGCCGGACTCGTCATACT-3'。

1.2.3 免疫組化法檢測eIF 3 b蛋白的陽性表達率 嚴格按照免疫組化二步法試劑盒操作說明書進行，組織常規切片，脫臘水化，采用3%的過氧化氫阻斷內源性過氧化物酶，抗原修復，封閉。滴加一抗（稀釋濃度為1∶1000），4℃孵育過夜，沖洗后滴加二抗（稀釋濃度為1∶2000），37℃孵育，沖洗后二氨基聯苯胺（diaminobenzidine，DAB）顯色，蘇木素復染，脫水透明，封片。以磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered solution，PBS）代替一抗作為陰性對照。結果判定[5]：eIF3b蛋白主要定位于細胞質，細胞質呈棕褐色顆粒為陽性表達。按染色強度評分：無著色為0分，淡黃色為1分，黃色為2分，棕褐色為3分。按陽性細胞所占百分比評分：＜5%為0分，5%～24%為1分，25%～49%為2分，50%～74%為3分，≥75%為4分。根據兩項評分的乘積判斷陽性結果，≥6分判斷為陽性，＜6分則為陰性。

1.3 統計學方法

采用SPSS 18.0軟件對所-有數據進行統計分析，計量資料以均數±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，多組間兩兩比較采用SNK-q檢驗，兩組間比較采用t檢驗；計數資料以例數和率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗；以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 eIF 3 b mRNA相對表達量的比較

乳腺癌組織中eIF3bmRNA的相對表達量為（2.85±0.22），明顯高于癌旁組織的（1.02±0.23），差異有統計學意義（t=53.634，P＜0.01）。

2.2 eIF 3 b蛋白陽性表達率的比較

乳腺癌組織中eIF3b蛋白的陽性表達率為75.56%（34/45），明顯高于癌旁組織的17.78%（8/45），差異有統計學意義（χ2=30.179，P＜0.01）。

2.3 不同臨床特征乳腺癌患者乳腺癌組織中eIF 3 b mRNA相對表達量和eIF 3 b蛋白陽性表達率的比較

不同年齡、病理類型、腫瘤直徑、組織學分級乳腺癌患者乳腺癌組織中eIF3bmRNA相對表達量的比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）；不同腋窩淋巴結轉移情況、TNM分期乳腺癌患者乳腺癌組織中eIF3bmRNA相對表達量的比較，差異均有統計學意義（t=4.921、3.360，P＜0.05）。不同年齡、病理類型、腫瘤直徑、組織學分級乳腺癌患者乳腺癌組織中eIF3b蛋白陽性表達率比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）；不同腋窩淋巴結轉移情況、TNM分期乳腺癌患者乳腺癌組織中eIF3b蛋白陽性表達率比較，差異均有統計學意義（χ2=7.228、8.427，P＜0.05）。（表1）

3 討論

eIF3是由a～m共13個亞基組成的多亞基真核細胞起始因子eIf，也是最大最復雜的起始因子，分子量為550～700 kD。eIF3參與了真核翻譯起始進程中大多數的反應。eIF3可以調控不同類型mRNA的翻譯起始過程，從而選擇性地調控蛋白的合成，最終調控細胞的生長[6]。研究顯示，eIF3可調控腫瘤的發生發展過程并影響細胞周期，如a、b、e和k亞基均可能參與細胞周期調控[7-8]。多項研究顯示，在腫瘤細胞的增殖和惡性轉化中，翻譯過程可能出現調控異常，但腫瘤的發生發展與翻譯調控失常之間的機制目前尚未研究清楚[9-11]。因此，直接參與這些生物學行為的關鍵因子，如eIF4E、eIF4G和eIF3亞基等將成為新的抗腫瘤治療的潛在靶點，成為研究熱點。其中eIF3的亞基eIF3b參與了蛋白翻譯和細胞周期的調控及腫瘤的發生發展過程。2012年，Liang等[12]發現，eIF3b在膠質瘤組織和細胞中高表達；Wang等[13]下調結腸癌細胞株中eIF3b的表達，結果發現，細胞的生長被有效抑制，細胞周期發生停滯。2013年，Wang等[14]將敲除eIF3b的膀胱癌細胞注射到裸鼠皮下，觀察細胞成瘤及肺轉移的效果，結果顯示，eIF3b可提供高腫瘤細胞的克隆形成能力，促進細胞轉移；該研究者同時提出，eIF3b可能通過整合素/黏著斑激酶（focal adhesion kinase，FAK）/蛋白激酶B（protein kinase B，PKB，又稱AKT）信號通路參與調控膀胱癌的發生與黏附過程。

表1 不同臨床特征乳腺癌患者乳腺癌組織中eIF 3 b mRNA的相對表達量和eIF 3 b蛋白陽性表達情況（n=45）

本研究為探討eIF3的亞基eIF3b在乳腺癌組織中的表達及在乳腺癌發生發展中的作用，檢測了乳腺癌組織及相應癌旁組織中eIF3bmRNA和eIF3b蛋白的表達情況，結果發現，45例乳腺癌組織中eIF3bmRNA的相對表達量和eIF3b蛋白的陽性表達率均明顯高于癌旁組織，差異均有統計學意義（P＜0.01），表明eIF3b在乳腺癌發生的過程中可能發揮著重要作用，提示eIF3b可能成為一種新的乳腺癌診斷標志物。此外，乳腺癌組織中eIF3bmRNA的相對表達量和eIF3b蛋白的陽性表達率與乳腺癌患者臨床特征的關系發現，eIF3bmRNA和eIF3b蛋白在乳腺癌組織中的表達可能與腋窩淋巴結轉移和TNM分期有關（P＜0.05），表明eIF3b不僅可能參與了乳腺癌發生過程，也可能在乳腺癌的增殖、轉移和侵襲過程中發揮促進作用，被認為可作為乳腺癌新的治療靶點。這可能是因為eIF3b是直接參與蛋白合成的關鍵因子，其異常表達可能參與了調控乳腺癌的增殖和轉移的過程，深入研究其調控作用機制，可能提供更直接、更有效的分子靶點治療新策略，是下一步研究的方向。

綜上所述，eIF3b表達增高不僅可能參與了乳腺癌發生過程，也可能在乳腺癌的增殖、轉移和侵襲過程中發揮促進作用。