實(shí)時(shí)熒光PCR方法與痰涂片法檢測(cè)結(jié)核桿菌的價(jià)值分析

梁斌

結(jié)核病是結(jié)核分枝桿菌感染所致慢性傳染性疾病，可發(fā)生于多個(gè)臟器，以肺結(jié)核最為多發(fā)[1]。早期快速、精確檢測(cè)出結(jié)核桿菌為控制結(jié)核病的關(guān)鍵[2]。目前分離培養(yǎng)仍然是檢測(cè)結(jié)核桿菌的金標(biāo)準(zhǔn)[3]，但檢測(cè)所需時(shí)間長(zhǎng)，效率低，可能延誤最佳治療時(shí)機(jī)。痰涂片為傳統(tǒng)結(jié)核桿菌檢測(cè)方法，具有簡(jiǎn)單、易行優(yōu)勢(shì)，但檢出率很低。隨著檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展，PCR檢測(cè)法開(kāi)始應(yīng)用于臨床當(dāng)中，其優(yōu)勢(shì)在于檢測(cè)速度快、成本低[4]。本次研究基于我中心結(jié)核門(mén)診實(shí)際，以分離培養(yǎng)為金標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)比分析實(shí)時(shí)熒光PCR法和痰涂片法檢測(cè)結(jié)果，以期明確實(shí)時(shí)熒光PCR法的應(yīng)用價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2017年1月至2019年2月我中心結(jié)核門(mén)診接診的臨床癥狀、體征以及胸部CT檢查高度疑似肺結(jié)核患者95例，其中男59例，女36例；年齡29～73歲，平均年齡(40.05±6.91)歲。采集患者合格晨痰標(biāo)本8～10 mL，密封后及時(shí)送檢，若不能及時(shí)檢測(cè)需置于4 ℃保存，保存時(shí)間不超過(guò)6 d。

疑似肺結(jié)核判定標(biāo)準(zhǔn)：以陳灝珠等主編的《內(nèi)科學(xué)》第8版中疑似肺結(jié)核的定義為標(biāo)準(zhǔn)，符合以下任意一條定義為疑似肺結(jié)核：持續(xù)≥3周有咳嗽、咳痰癥狀，或咯血、痰中帶血；痰涂片抗酸桿菌檢測(cè)呈現(xiàn)陰性，伴有或不伴有咳嗽、咳痰、全身結(jié)核中毒，胸部影像學(xué)檢查疑似活動(dòng)性結(jié)核病變。

1.2 方法

1.2.1 試劑和儀器 抗酸染色液、營(yíng)養(yǎng)添加劑、雜菌抑制劑均購(gòu)自廈門(mén)海菲生物技術(shù)有限公司，Xpert MTB/RIF (結(jié)核分枝桿菌rpoB基因和突變檢測(cè)試劑盒) 購(gòu)自天津儀美科技有限公司，MGIT培養(yǎng)管購(gòu)自美國(guó)BD公司微生物公司，Vortex gene2漩渦震蕩儀購(gòu)自河北潤(rùn)創(chuàng)科技開(kāi)發(fā)有限公司，GeneXpert購(gòu)自天津儀美科技有限公司。

1.2.2 痰涂片檢測(cè) 取出載玻片，以竹簽蘸取0.05～0.10 mL的干酪樣、膿樣痰液標(biāo)本，將竹簽上的標(biāo)本涂抹于載玻片右側(cè)2/3中央位置，涂抹范圍為2.0 cm×2.5 cm，形成橢圓形痰膜，放置于自然環(huán)境中晾干，加熱固定，行抗酸染色鏡檢：在玻片上滴加1滴石碳酸復(fù)紅染色液，微火加熱，出現(xiàn)蒸汽后停止加熱，以蒸餾水水洗；以0.5%濃度鹽酸酒精做脫色處理，至沒(méi)有紅色染料脫落為止，以蒸餾水水洗；堿性美蘭復(fù)染，持續(xù)20～60 s，以蒸餾水水洗；用吸水紙吸干后用油鏡進(jìn)行鏡檢。結(jié)果判定，陰性：持續(xù)觀察300個(gè)視野均未見(jiàn)抗酸桿菌；陽(yáng)性：持續(xù)觀察300個(gè)視野后發(fā)現(xiàn)單個(gè)或多個(gè)抗酸桿菌，其中300個(gè)視野中有1～8條抗酸桿菌為(+)，100個(gè)視野中有3～9條抗酸桿菌為(++)，10個(gè)視野中有1～9條抗酸桿菌為(+++)，任意視野中抗酸桿菌數(shù)均≥10條為(++++)。

1.2.3 實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè) 采集5 mL痰液標(biāo)本，以12 000 r/min的速度離心處理5 min，倒出上清液，保留離心處理后的沉淀物，使用無(wú)菌移液管吸取0.5 mL痰沉淀物至圓錐形、帶螺旋蓋的試管中，添加1.5 mL 樣品處理劑(SR)充分震蕩10 ～20次，室溫下放置15 min，再次震蕩10～20次，使樣品液化。以試劑盒中的無(wú)菌移液管吸取足量液化樣本(樣本液面在移液管最低標(biāo)記處)，打開(kāi)XpertMTB/RIF檢測(cè)匣，緩慢倒入檢測(cè)液，蓋緊蓋子，啟動(dòng)GeneXpert檢測(cè)儀進(jìn)行檢測(cè)，至檢測(cè)反應(yīng)結(jié)束后取出檢測(cè)匣，在系統(tǒng)中查看檢測(cè)結(jié)果，Ct值代表DNA濃度，Ct值≤28為陽(yáng)性。

1.2.4 MGIT960液體分離培養(yǎng) 以50 mL離心管取2 mL痰液，并加入2 mL濃度4%的氫氧化鈉(NaOH)，充分渦旋震蕩，放置于空氣中30 min，并加入40 mL PBS溶液，監(jiān)測(cè)混合液pH值，中和至6.8時(shí)，以12 000 r/min的速度離心處理5 min，倒出上清液，保留離心處理后的沉渣。在離心管中滴入0.5 mL生理鹽水，以吸管吹打沉淀物，使其完全混勻，留待接種。取MGIT培養(yǎng)管，并加入0.8 mL的營(yíng)養(yǎng)添加劑、雜菌抑制劑的混合液，取0.5 mL留待接種樣本，將其接種于MGIT培養(yǎng)管中，靜置于BACTEC MGIT-960 Tb中培養(yǎng)。在顯微鏡下觀察菌落生長(zhǎng)情況，陽(yáng)性判定標(biāo)準(zhǔn)參考痰涂片檢測(cè)。

1.3 觀察指標(biāo) 統(tǒng)計(jì)痰涂片法、實(shí)時(shí)熒光PCR法、MGIT960液體分離培養(yǎng)法檢測(cè)結(jié)果，并以MGIT960液體分離培養(yǎng)法結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)比實(shí)時(shí)熒光PCR法、痰涂片法檢測(cè)準(zhǔn)確性、敏感度、特異度。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用統(tǒng)計(jì)學(xué)SPSS 23.0軟件分析研究數(shù)據(jù)，計(jì)數(shù)資料采用率表示，行χ2檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。采用Mcnemar檢驗(yàn)分析檢測(cè)結(jié)果，采用Kappa檢驗(yàn)分析一致性，K≥0.75為一致性較好，0.4≤K＜0.75為一致性中等，K＜0.4為一致性較差。

2 結(jié)果

2.1 痰涂片法、實(shí)時(shí)熒光PCR法、MGIT960液體分離培養(yǎng)法結(jié)核桿菌陽(yáng)性檢出率比較 痰涂片法結(jié)核桿菌陽(yáng)性檢出率為29.47%(28/95)，實(shí)時(shí)熒光PCR法檢出率為37.89%(36/95)，MGIT960液體分離培養(yǎng)法檢出率為38.95%(37/95)，三種檢測(cè)方法結(jié)核桿菌陽(yáng)性檢出率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=2.239，P＝0.326＞0.05)。

2.2 痰涂片法、實(shí)時(shí)熒光PCR法檢測(cè)結(jié)果與金標(biāo)準(zhǔn)比較(表1) 痰涂片法檢測(cè)結(jié)果與MGIT960液體分離培養(yǎng)法結(jié)果對(duì)比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05)，與MGIT960液體分離培養(yǎng)法結(jié)果一致性中等(K＝0.467)。

實(shí)時(shí)熒光PCR法檢測(cè)結(jié)果與MGIT960液體分離培養(yǎng)法結(jié)果對(duì)比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05)，與MGIT960液體分離培養(yǎng)法結(jié)果一致性較好(K＝0.933)。

2.3 實(shí)時(shí)熒光PCR法、痰涂片法檢測(cè)準(zhǔn)確率、敏感度、特異度比較(表2) 實(shí)時(shí)熒光PCR法檢測(cè)準(zhǔn)確率、敏感度均高于痰涂片法，對(duì)比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，兩種檢測(cè)方法特異度比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

表2 實(shí)時(shí)熒光PCR法、痰涂片法檢測(cè)準(zhǔn)確率、敏感度、特異度比較 單位：%

3 討論

結(jié)核病具有傳染性強(qiáng)、危害性大等特點(diǎn)，若未及時(shí)治療可損傷呼吸系統(tǒng)，影響患者各項(xiàng)生理機(jī)能，甚至危及生命[5]。尋找快捷有效的結(jié)核病診斷手段能夠盡早明確患者病情狀況，指導(dǎo)臨床制定有效防治方案。

液體分離培養(yǎng)法為結(jié)核桿菌檢測(cè)金標(biāo)準(zhǔn)，但是結(jié)核桿菌的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)特殊，其對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收速度慢，導(dǎo)致菌落生長(zhǎng)緩慢，普通培養(yǎng)基需要3～8周，而快讀培養(yǎng)基也需要7～10 d，其檢測(cè)耗時(shí)長(zhǎng)[6]，會(huì)延誤早期診斷、治療時(shí)間，并不是理想的檢測(cè)手段。痰涂片法是結(jié)核桿菌檢查中最常用的手段，具有操作簡(jiǎn)單、易于施行、對(duì)檢測(cè)人員水平要求不高等優(yōu)勢(shì)[7]。但是痰液標(biāo)本中除了含有結(jié)核桿菌外，多含有其他非結(jié)核桿菌，而其他雜菌也會(huì)使抗酸染色，形成假陽(yáng)性，而有些患者則因結(jié)核桿菌抗酸染色不明顯而漏診，檢測(cè)準(zhǔn)確性不能得到保證，敏感度、特異度差，誤診率高。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，學(xué)界開(kāi)始關(guān)注從分子生物角度分析結(jié)核桿菌，實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)法應(yīng)運(yùn)而生。實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)法通過(guò)檢測(cè)結(jié)核桿菌DNA來(lái)判斷患者是否有結(jié)核桿菌感染，進(jìn)而診斷其是否有結(jié)核病[8]。實(shí)時(shí)熒光PCR的應(yīng)用為提升結(jié)核桿菌早期檢出率提供可能。實(shí)時(shí)熒光PCR法原理為：將熒光反應(yīng)物加入PCR反應(yīng)體系當(dāng)中，使其和PCR擴(kuò)增物關(guān)聯(lián)，以擴(kuò)增反應(yīng)體系中熒光強(qiáng)度為依據(jù)定量分析特定DNA，既能夠避免檢測(cè)過(guò)程中受污染問(wèn)題影響，又能夠提升檢測(cè)速度、檢測(cè)敏感度、特異度，且實(shí)現(xiàn)了自動(dòng)化定量分析，其適用范圍廣泛，在無(wú)法進(jìn)行病原微生物培養(yǎng)及培養(yǎng)困難的病原菌檢測(cè)中普遍應(yīng)用[9]。

本次研究中實(shí)時(shí)熒光PCR法、MGIT960液體分離培養(yǎng)法結(jié)核桿菌陽(yáng)性檢出率稍高于痰涂片法，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，實(shí)時(shí)熒光PCR法檢測(cè)結(jié)果與MGIT960液體分離培養(yǎng)法一致性較好(K＝0.933)。痰涂片法檢測(cè)結(jié)果與MGIT960液體分離培養(yǎng)法結(jié)果一致性中等(K＝0.467)。實(shí)時(shí)熒光PCR法檢測(cè)準(zhǔn)確率、敏感度均高于痰涂片法(P＜0.05)，證實(shí)實(shí)時(shí)熒光PCR法具有良好應(yīng)用價(jià)值[10]。

另外，筆者在臨床當(dāng)中發(fā)現(xiàn)實(shí)時(shí)熒光PCR法檢測(cè)效率高，且檢測(cè)費(fèi)用相對(duì)較低，患者普遍可以承擔(dān)，因此具有推廣可行性。綜合分析實(shí)時(shí)熒光PCR法的臨床檢驗(yàn)時(shí)間情況，筆者認(rèn)為將實(shí)時(shí)熒光PCR法作為結(jié)核桿菌的檢測(cè)方法更有助于提升結(jié)核病的檢出率，指導(dǎo)臨床采取有效防治措施。需要注意的是實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)也存在假陰性、假陽(yáng)性病例，其原因在于此種檢測(cè)方法能夠?qū)Y(jié)核桿菌DNA進(jìn)行定量分析，但無(wú)法辨別活性菌和死菌，因此會(huì)在一定程度上影響檢測(cè)結(jié)果，因此PCR檢測(cè)法適用于肺結(jié)核早期篩查，而不能作為確診依據(jù)。

綜上所述，實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)結(jié)核桿菌的檢出率高，診斷準(zhǔn)確率、敏感度高，與液體分離培養(yǎng)法一致性較好，其應(yīng)用價(jià)值高于痰涂片法，可推廣應(yīng)用。