去唾液酸糖蛋白受體介導(dǎo)的新型肝細(xì)胞靶向磁共振對(duì)比劑的體外實(shí)驗(yàn)研究

劉冠宇，劉 屹

（1.遼寧省腫瘤醫(yī)院醫(yī)學(xué)影像科，遼寧 沈陽(yáng) 110042；2.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院醫(yī)學(xué)影像科，遼寧 沈陽(yáng) 110001）

去唾液酸糖蛋白受體（Asialoglycoprotein receptor，ASGPR）是特異性識(shí)別、結(jié)合并內(nèi)吞血液循環(huán)中的一些失去末端唾液酸而暴露半乳糖殘基（Gal）和N-乙酰半乳糖胺殘基（GalNAc）的糖蛋白[1]。ASGPR 大量表達(dá)于肝竇狀間隙的肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞表面，平均每個(gè)肝細(xì)胞上約有500 000 個(gè)結(jié)合位點(diǎn)[2-5]，在患有各種肝病（包括急性肝炎、慢性肝炎和肝硬化）的患者中肝細(xì)胞表面的ASGPR 表達(dá)數(shù)量及功能會(huì)發(fā)生改變，依此可以間接評(píng)價(jià)肝臟功能損傷程度。

超微型超順磁性氧化鐵（Ultrasmall superparamagnetic iron oxide，USPIO）顆粒小、穿透性強(qiáng)，在體內(nèi)循環(huán)時(shí)間較長(zhǎng)，且具有生物可降解性，在MR 分子影像探針的研究中應(yīng)用較為廣泛，主要產(chǎn)生較強(qiáng)的T2對(duì)比效應(yīng)[6]。聚乙二醇（Polyethylene glycol，PEG）是一種廣泛用于增強(qiáng)疏水性藥物溶解度的水溶性聚合物，有研究表明經(jīng)PEG 包被后的氧化鐵顆粒水溶性及穩(wěn)定性極好[7]，還能逃避網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的非特異性吞噬[8-9]。人血清白蛋白（Human serum albumin，HSA）是人血清中最豐富的蛋白質(zhì)，能轉(zhuǎn)運(yùn)藥物、毒素、營(yíng)養(yǎng)素、激素和代謝物等小疏水分子[10]。MRI 檢查安全無(wú)輻射、分辨率高、不同掃描序列可以反應(yīng)組織及病變的多種生物學(xué)特性，在肝臟病變的診斷、個(gè)性化治療方案的選擇及療效評(píng)價(jià)方面具有絕對(duì)優(yōu)勢(shì)。本研究構(gòu)建肝細(xì)胞特異性攝取的新型磁共振對(duì)比劑（Fe-HSA-LA），檢測(cè)其對(duì)肝細(xì)胞的靶向性及作為磁共振對(duì)比劑的可行性。

1 材料和方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料和所用細(xì)胞系

Fe-HSA-LA（南京東納生物科技有限公司），PEG-USPIO（北京萬(wàn)德高科技發(fā)展有限公司），HSA（Sigma），乳糖酸（阿拉丁試劑，貨號(hào)L109639-25g），胎牛血清（Gibco 公司），RPMI-1640 培養(yǎng)基（江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司），0.25%Trypsin-EDTA（江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司），磷酸鹽緩沖溶液（江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司），普魯士藍(lán)染色試劑盒（北京索寶來(lái)有限公司），Cell Counting Kit-8（CCK-8）試劑盒（日本同仁化學(xué)研究所），瓊脂糖（Biowest Agarose），4%多聚甲醛（北京索萊寶科技有限公司）。大鼠正常肝細(xì)胞（BRL 3A cells）（購(gòu)自KeyGEN BioTECH），小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞（Colon26 cells）（Kanazawa University School of Medicine，Kanazawa，Japan）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 Fe-HSA-LA 表征分析及T2弛豫率測(cè)定

1.2.2 BRL 3A 細(xì)胞及Colon26 細(xì)胞體外培養(yǎng)

將BRL 3A 細(xì)胞接種于補(bǔ)充有10%胎牛血清（FBS；Gibco）的RPMI-1640 培養(yǎng)基中，Colon26 細(xì)胞接種于補(bǔ)充有5%磷酸鹽緩沖溶液（PBS）的RPMI-1640 培養(yǎng)基中，放入37 ℃、5%CO2、100%濕度的恒溫孵箱培養(yǎng)過(guò)夜，鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)，更換新培養(yǎng)基，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)80%～90%時(shí)傳代。實(shí)驗(yàn)所用細(xì)胞傳代數(shù)在3～9 代之間。

1.2.3 細(xì)胞毒性檢測(cè)

采用CCK-8 試劑盒對(duì)Fe-HSA-LA、PEG-USPIO 的細(xì)胞毒性進(jìn)行評(píng)價(jià)，具體操作如下：BRL 3A細(xì)胞、Colon26 細(xì)胞分別用0.25%胰蛋白酶消化，離心后重懸進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，將細(xì)胞濃度調(diào)節(jié)為1.0×105mL-1，96 孔板中每孔加入0.1 mL 細(xì)胞懸液，37℃、5%CO2、100%濕度培養(yǎng)箱中孵育24 h。棄掉各孔培養(yǎng)基，用PBS 洗3 次，分別加入不同濃度的Fe-HSALA、PEG-USPIO（0、6.25 μg Fe/mL、12.5 μg Fe/mL、25 μg Fe/mL、50 μg Fe/mL、100 μg Fe/mL、200 μg Fe/mL），24 h 后棄上清液，加入100 μL 培養(yǎng)基與10 μL CCK-8 的混合液，繼續(xù)孵育2 h 后測(cè)490 nm 處吸光度值（OD 值），計(jì)算細(xì)胞存活率，公式如下：細(xì)胞存活率（%）=（ODsample-ODblank）/（ODcontrol-ODblank）×100%。

1.2.4 普魯士藍(lán)染色

BRL 3A 細(xì)胞、Colon26 細(xì)胞分別用0.25%胰蛋白酶消化，離心后重懸細(xì)胞計(jì)數(shù)后，將細(xì)胞濃度調(diào)整為1.0×105mL-1，6 孔板中每孔加入2 mL 細(xì)胞懸液，37℃、5%CO2、100%濕度培養(yǎng)箱中孵育24 h。次日，取出6 孔板，棄掉孔內(nèi)培養(yǎng)基后，PBS 洗3 遍，分別加入10 μg Fe/mL 及50 μg Fe/mL 濃度的Fe-HSALA、PEG-USPIO 培養(yǎng)基稀釋液，37℃、5%CO2、100%濕度培養(yǎng)箱中孵育24 h。首先在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。棄上清液，PBS 沖洗3 次，加入4%多聚甲醛固定細(xì)胞20 min，進(jìn)一步用蒸餾水洗滌3 次。加入普魯士藍(lán)染色液（10%亞鐵氰化鉀∶10%鹽酸=1∶1 混勻）作用30 min，蒸餾水沖洗3 遍后伊紅復(fù)染5 min，于倒置顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.5 標(biāo)記細(xì)胞體外磁共振成像

“共享經(jīng)濟(jì)”是以互聯(lián)網(wǎng)技術(shù)為載體，以獲得一定的濟(jì)效益為目的，使大范圍內(nèi)的陌生人與陌生人之間能夠?qū)崿F(xiàn)資源共享，發(fā)揮物品最大的使用價(jià)值?！肮蚕斫?jīng)濟(jì)”主要依靠商品的供給者、需求者以及線上的共享經(jīng)濟(jì)平臺(tái)共同實(shí)現(xiàn)。而隨著互聯(lián)網(wǎng)技術(shù)的不斷發(fā)展與完善，人們通過(guò)線上APP就能進(jìn)行商業(yè)交易和資源共享，這也大大降低了交易成本，“共享經(jīng)濟(jì)”的浪潮也由此而來(lái)。

將BRL 3A 細(xì)胞及Colon26 細(xì)胞濃度調(diào)整為1.0×105mL-1，37℃、5%CO2、100%濕度培養(yǎng)箱中過(guò)夜。次日，棄上清液，PBS 洗3 遍，分別加入0、0.5、3.125、6.25、12.5、25、50 μg Fe/mL 濃度的Fe-HSALA、PEG-USPIO 培養(yǎng)基稀釋液孵育24 h。用0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞，用1%瓊脂糖膠溶液將細(xì)胞團(tuán)重懸于2 mL Eppendorf 管內(nèi)。為了減低由外磁場(chǎng)不均勻性產(chǎn)生的干擾，以及來(lái)自周?chē)諝獾囊赘行詡斡?，將這些Eppendorf 管嵌入填充有1%瓊脂糖凝膠的塑料容器中行T2加權(quán)成像序列及T2map 序列掃描。T2加權(quán)成像序列參數(shù)如下：TR=3 000 ms；TE=85.6 ms；視野（FOV）=21×21 cm2；像素=320×320；層厚=1 mm；激發(fā)次數(shù)（NEX）=4。T2map 序列參數(shù)如下：TR=1 220 ms；TE=9.2～73.3 ms；FOV=21×21 cm2；像素=320×320；層厚=1 mm；NEX=4。將圖像傳至GE ADW 4.4 工作站，通過(guò)GE Functool-T2mapping 軟件選取3 個(gè)截面畫(huà)出感興趣區(qū)（ROI=25 mm2），計(jì)算出每組樣品的T2弛豫時(shí)間及弛豫率（R2，單位：s-1·mM-1，R2=1/T2）。通過(guò)AAS 法測(cè)定細(xì)胞內(nèi)的鐵含量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism 7.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)中的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示。采用獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)比較標(biāo)記細(xì)胞的結(jié)合鐵量，采用Pearson 相關(guān)分析進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)鐵含量與R2之間相關(guān)性分析。P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Fe-HSA-LA 表征分析及T2弛豫率測(cè)定結(jié)果

TEM 顯示Fe-HSA-LA 及PEG-USPIO 呈大小均勻、分布均勻、較為規(guī)則的類圓形（圖1）。AAS 法測(cè)定Fe-HSA-LA 和PEG-USPIO 的Z-平均水合粒徑分別為（53.38±17.07）nm 和（16.57±4.18）nm（圖2）。Fe-HSA-LA 和PEG-USPIO 的Zeta 電位分別為（-23.3±9.10）mV 和（2.57±0.83）mV（表1）。Fe-HSALA 和PEG-USPIO 的T2弛豫率分別為168.40 mM-1s-1和416.30 mM-1s-1（圖3b，表1）。

表1 Fe-HSA-LA 和PEG-USPIO Z-平均水合粒徑、Zeta 電位及T2弛豫率

2.2 體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 細(xì)胞毒性檢測(cè)結(jié)果

當(dāng)BRL 3A 細(xì)胞與濃度低于或等于50 μg Fe/mL的Fe-HSA-LA 孵育24 h 后，細(xì)胞存活率均維持在95%水平以上。當(dāng)BRL 3A 細(xì)胞與濃度為200 μg Fe/mL 的Fe-HSA-LA 孵育24 h 后，細(xì)胞的存活率為（66.00±5.85）%。

2.2.2 普魯士藍(lán)染色結(jié)果

光鏡下大量細(xì)胞內(nèi)可見(jiàn)藍(lán)染顆粒，特別是在Fe-HSA-LA 標(biāo)記的BRL 3A 細(xì)胞中更為顯著（圖5）。AAS 檢測(cè)兩種納米鐵顆粒分別標(biāo)記兩種細(xì)胞的鐵含量（圖6）。當(dāng)Fe-HSA-LA 和PEG-USPIO 的孵育濃度為10 μg Fe/mL 時(shí)，BRL 3A 細(xì)胞中Fe-HSALA 的累積最高，平均鐵含量為（173.30±12.51）pg Fe/cell。孵育濃度為50 μg Fe/mL 時(shí)，BRL 3A 細(xì)胞的平均鐵含量（（503.09±26.86）pg Fe/cell）是在孵育濃度為10 μg Fe/mL 時(shí)鐵含量的近3 倍。

圖1 TEM 圖像。圖1a：PEG-USPIO；圖1b：Fe-HSA-LA。Figure 1.TEM image.Figure 1a:PEG-USPIO;Figure 1b:Fe-HSA-LA.

圖2 Z-平均水合粒徑。圖2a：PEG-USPIO；圖2b：Fe-HSA-LA。Figure 2.Z-average hydrated particle size.Figure 2a:PEG-USPIO;Figure 2b:Fe-HSA-LA.

圖3a PEG-USPIO 及Fe-HSA-LA T2加權(quán)圖像。圖3b PEG-USPIO 及Fe-HSA-LA T2弛豫率。Figure 3a.T2WI of the PEG-USPIO and Fe-HSA-LA.Figure 3b.T2relaxation rate of PEG-USPIO and Fe-HSA-LA.

圖4 Fe-HSA-LA 和PEG-USPIO 孵育BRL 3A 細(xì)胞24 h 后的細(xì)胞存活率。Figure 4.Cell viability after incubation of BRL 3A cells with Fe-HSA-LA and PEG-USPIO for 24 h.

2.2.3 體外磁共振成像結(jié)果

圖7a 所示為不同濃度Fe-HSA-LA 和PEGUSPIO 標(biāo)記BRL 3A 細(xì)胞和Colon26 細(xì)胞的MR T2加權(quán)圖像，T2WI 信號(hào)強(qiáng)度隨濃度增加而逐漸降低，在相同孵育濃度條件下，以Fe-HSA-LA 標(biāo)記的BRL 3A 細(xì)胞信號(hào)減低較為明顯。圖7b 所示4 種標(biāo)記細(xì)胞的MRI R2值隨濃度增加逐漸增高，當(dāng)濃度大于或等于3.125 μg Fe/mL 時(shí)，以Fe-HSA-LA 標(biāo)記的BRL 3A 細(xì)胞組的R2值變化最顯著（P＜0.05）。

圖8a 所示為AAS 測(cè)定不同濃度的Fe-HSALA 和PEG-USPIO 標(biāo)記的BRL 3A 細(xì)胞及Colon26細(xì)胞結(jié)合鐵量。隨著濃度的增加，標(biāo)記細(xì)胞的鐵含量增加。當(dāng)濃度大于或等于3.125 μg Fe/mL 時(shí)，F(xiàn)e-HSALA 標(biāo)記的BRL 3A 細(xì)胞結(jié)合鐵量最高（P＜0.05）。

圖8b 為不同標(biāo)記細(xì)胞的MRI R2值與AAS 測(cè)定細(xì)胞結(jié)合鐵量的相關(guān)性分析結(jié)果，可見(jiàn)MRI R2值與AAS 測(cè)定細(xì)胞結(jié)合鐵量具有良好的相關(guān)性。相關(guān)系數(shù)分別為：Fe-HSA-LA 標(biāo)記的BRL 3A 細(xì)胞r=0.968 1，F(xiàn)e-HSA-LA 標(biāo)記的Colon26 細(xì)胞r=0.994 1，PEG-USPIO 標(biāo)記的BRL 3A 細(xì)胞r=0.961 7，PEGUSPIO 標(biāo)記的Colon26 細(xì)胞r=0.996 4。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)采用表面修飾有PEG 的USPIO 作為靶向探針的信號(hào)組件（PEG-USPIO），并將PEG-USPIO與HSA 及乳糖酸偶聯(lián)，以肝細(xì)胞膜上的ASGPR 作為標(biāo)靶，構(gòu)建新型肝細(xì)胞靶向磁共振對(duì)比劑Fe-HSA-LA。PEG-USPIO 在偶聯(lián)HSA 及乳糖酸后，顆粒水合粒徑增加，但從TEM 圖中可見(jiàn)偶聯(lián)前后的粒徑未見(jiàn)明顯改變，因激光粒度儀測(cè)得的粒徑為水合粒徑，是包括PEG 等包被物厚度的實(shí)際納米顆粒體積，而TEM 只能觀察到信號(hào)組件氧化鐵納米顆粒的大小、形態(tài)，其包被物的厚度是觀測(cè)不到的[7]。

圖5 Fe-HSA-LA 及PEG-USPIO 標(biāo)記BRL 3A 細(xì)胞及Colon26 細(xì)胞的普魯士藍(lán)染色結(jié)果。Figure 5.Determination of iron content in Fe-HSA-LA and PEG-USPIO labeled BRL 3A cells and Colon26 cells by AAS.

圖6 AAS 測(cè)定Fe-HSA-LA 和PEG-USPIO 標(biāo)記BRL 3A 細(xì)胞和Colon26 細(xì)胞內(nèi)鐵含量。Figure 6.Fe-HSA-LA and PEG-USPIO labeled BRL 3A cells and Colon26 cells AAS were assayed for cellular iron content after prussian blue staining.

弛豫率是可以衡量納米鐵顆粒磁學(xué)性能的指標(biāo)，T2弛豫率高，表明其對(duì)比效果好[11]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明PEG-USPIO 的弛豫率較Fe-HSA-LA 的弛豫率高，即在鐵濃度相同時(shí)，PEG-USPIO 較Fe-HSALA 的T2信號(hào)降低更明顯。分析原因可能是因?yàn)镻EG-USPIO 經(jīng)與HSA 及乳糖酸偶聯(lián)后，其表面電位發(fā)生了變化。Zeta 電位與膠體分散穩(wěn)定性相關(guān)，隨著Zeta 電位增高，體系穩(wěn)定性越好[12]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，F(xiàn)e-HSA-LA 和PEG-USPIO 納米鐵顆粒的Zeta電位分別為（-23.3±9.10）mV 和（2.57±0.83）mV，偶聯(lián)后的納米鐵顆粒體系穩(wěn)定性較好，同時(shí)偶聯(lián)前后兩種納米鐵顆粒的表面電荷發(fā)生了改變，由PEG-USPIO 表面帶正電荷轉(zhuǎn)變?yōu)镕e-HSA-LA 表面帶負(fù)電荷。另有研究表明，與磁顆粒尺寸的變化相比，偶聯(lián)包被物厚度對(duì)弛豫率的影響更大，弛豫率隨著偶聯(lián)包被物厚度計(jì)算在內(nèi)的總粒徑增加而降低[13]。盡管如此，F(xiàn)e-HSA-LA（168.4 mM-1s-1）和PEG-USPIO（461.3 mM-1s-1）的弛豫率都可以滿足磁共振成像的要求[14]。

圖7a Fe-HSA-LA 和PEG-USPIO 標(biāo)記BRL 3A 細(xì)胞和Colon26 細(xì)胞的MR T2加權(quán)圖。圖7b 標(biāo)記細(xì)胞的MRI R2值在不同濃度的Fe-HSA-LA 和PEG-USPIO 中的變化曲線。Figure 7a.T2WI of Fe-HSA-LA and PEG-USPIO labeled BRL 3A cells and Colon26 cells.Figure 7b.The MRI R2values of the labeled cells under different concentrations of Fe-HSA-LA and PEG-USPIO.

圖8a Fe-HSA-LA 和PEG-USPIO 標(biāo)記BRL 3A 細(xì)胞及Colon26 細(xì)胞結(jié)合鐵量。圖8b 4 種標(biāo)記細(xì)胞的MRI R2值與AAS 測(cè)定細(xì)胞結(jié)合鐵量的相關(guān)性分析。Figure 8a.Fe-HSA-LA and PEG-USPIO labeled BRL 3A cells and Colon26 cells bind iron.Figure 8b.Correlation analysis between MRI R2values of four labeled cells and AAS determination of cell bound iron content.

納米顆粒的潛在毒性是決定其能否在臨床成像中應(yīng)用的主要因素，也是合成新型對(duì)比劑需要密切關(guān)注的問(wèn)題[15]。因此，我們將濃度為6.25～200 μg Fe/mL 的Fe-HSA-LA 和PEG-USPIO 分 別與BRL 3A細(xì)胞和Colon26 細(xì)胞孵育24 h，細(xì)胞毒性檢測(cè)結(jié)果顯示，在Fe-HSA-LA 濃度小于或等于50 μg Fe/mL時(shí)，細(xì)胞存活率達(dá)到95%以上，提示Fe-HSA-LA 可作為MRI 對(duì)比劑應(yīng)用于體外研究。普魯士藍(lán)染色結(jié)果提示，BRL 3A 細(xì)胞內(nèi)可見(jiàn)較多藍(lán)染顆粒，表明BRL 3A 細(xì)胞對(duì)Fe-HSA-LA 具有較高的攝取水平，進(jìn)一步證實(shí)BRL 3A 細(xì)胞對(duì)Fe-HSA-LA 的攝取主要依賴于ASGPR。

Fe-HSA-LA 標(biāo)記的BRL 3A 細(xì)胞表現(xiàn)出的MR T2WI 信號(hào)減低最為明顯，AAS 測(cè)定相應(yīng)標(biāo)記細(xì)胞結(jié)合鐵量結(jié)果同樣表明隨著兩種納米鐵顆粒孵育濃度增加，F(xiàn)e-HSA-LA 標(biāo)記的BRL 3A 細(xì)胞的鐵含量增加最顯著；當(dāng)濃度大于或等于3.125 μg Fe/mL時(shí)，BRL 3A 細(xì)胞對(duì)Fe-HSA-LA 的結(jié)合能力高于Colon26 細(xì)胞，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。不同標(biāo)記細(xì)胞的MRI R2值與AAS 測(cè)定細(xì)胞結(jié)合鐵量具有良好的相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)均在0.95 以上。

綜上所述，BRL 3A 細(xì)胞結(jié)合Fe-HSA-LA 主要?dú)w因于細(xì)胞膜上的ASGPR 對(duì)其的特異性識(shí)別內(nèi)吞，F(xiàn)e-HSA-LA 可以作為肝細(xì)胞靶向磁共振對(duì)比劑。對(duì)于受體靶向?qū)Ρ葎┑暮铣蛇€有優(yōu)化和改進(jìn)的空間。未在亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)水平進(jìn)一步確定Fe-HSA-LA細(xì)胞內(nèi)的分布為本研究的局限性之一，合成的Fe-HSA-LA 在體內(nèi)肝的靶向能力有待進(jìn)一步驗(yàn)證。