高效液相色譜法測(cè)定松藻多糖中醛糖的絕對(duì)構(gòu)型

李娜?于金換

摘 要：本論文通過(guò)高效液相色譜（HPLC）法對(duì)3個(gè)松藻多糖組分進(jìn)行單糖組成及單糖絕對(duì)構(gòu)型的測(cè)定，該方法簡(jiǎn)單快速，所需的高效液相色譜儀及C18色譜柱在實(shí)驗(yàn)室普遍應(yīng)用，為天然多糖中單糖絕對(duì)構(gòu)型的測(cè)定提供參考。

關(guān)鍵詞：高效液相色譜法;醛糖;絕對(duì)構(gòu)型

醛糖是生物分子中最重要的結(jié)構(gòu)成分之一，如多糖、核酸、糖脂和糖蛋白等。此外，植物中存在大量的次生代謝物，如萜類(lèi)、類(lèi)固醇和類(lèi)黃酮，它們與醛糖結(jié)合，以糖苷的形式存在。醛糖是具有旋光活性的化合物，在天然產(chǎn)物化學(xué)中需要確認(rèn)其絕對(duì)構(gòu)型。如果糖基的絕對(duì)構(gòu)型沒(méi)有確定，一個(gè)復(fù)雜多糖的結(jié)構(gòu)表征是不完整的。因此，更可靠和簡(jiǎn)便的確定單糖絕對(duì)構(gòu)型的方法是闡明復(fù)雜多糖完整結(jié)構(gòu)的有價(jià)值的工具。目前已應(yīng)用的測(cè)定方法有高效液相色譜法、氣液色譜或氣質(zhì)聯(lián)用、毛細(xì)管電泳法。然而，使用配備紫外檢測(cè)器和C18反相柱的高效液相色譜來(lái)測(cè)定單糖絕對(duì)構(gòu)型的研究并不多，本文采用一種簡(jiǎn)便快速的高效液相色譜法鑒別松藻多糖中醛糖的絕對(duì)構(gòu)型。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

單糖標(biāo)準(zhǔn)品、1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP），美國(guó)Sigma-Aldrich公司;乙腈（色譜純），美國(guó)Tedia公司;L-半胱氨酸甲酯、異硫氰酸鄰甲苯酯等其它試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。Agilent Eclipse XDB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm，美國(guó)Agilent公司）;高效液相色譜儀（Agilent 1260，美國(guó)Agilent公司）。

1.2 方法

1.2.1 單糖組成分析

3個(gè)松藻來(lái)源的多糖組分分別為CP1、CP2、CP3，采用PMP柱前衍生高效液相色譜法對(duì)單糖組成進(jìn)行分析。

柱前衍生：取完全酸水解樣品及濃度為10 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品混合溶液各100 μL，加入120 μL 0.5 mol/L的PMP甲醇溶液和100 μL 0.3 mol/L的氫氧化鈉溶液，70 ℃水浴中反應(yīng)1 h，然后加入100 μL 0.3 mol/L的HCl溶液終止反應(yīng)，萃取，離心，上清液經(jīng)0.22 μm的濾膜過(guò)濾，即可進(jìn)行HPLC分析。

色譜條件：色譜柱為Agilent Ecli-pse XDB-C18（5 μm，4.6 μm×25.0 cm）;柱溫為35 ℃;檢測(cè)器為紫外檢測(cè)器（波長(zhǎng)254 nm）;進(jìn)樣量為10 μL;流動(dòng)相為乙腈：磷酸鹽緩沖液=17∶83（V∶V）;流速為1.0 mL/min。

將樣品色譜圖與單糖標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖比較，根據(jù)各峰的保留時(shí)間可知單糖種類(lèi)，根據(jù)峰面積計(jì)算摩爾比。

1.2.2 單糖絕對(duì)構(gòu)型（D/L）的測(cè)定

采用高效液相色譜法對(duì)3個(gè)松藻多糖中主要單糖種類(lèi)的絕對(duì)構(gòu)型進(jìn)行測(cè)定[1]。

衍生物制備：取單糖標(biāo)準(zhǔn)品和完全酸水解的多糖樣品各2 mg，分別置于兩個(gè)EP管中，各加入2 mg L-半胱氨酸甲酯和0.4 mL吡啶，于60 ℃水浴反應(yīng)1 h，然后加入2 mg異硫氰酸鄰甲苯酯，于60 ℃水浴中反應(yīng)1 h，過(guò)濾，即可進(jìn)行高效液相色譜分析。對(duì)比標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的液相色譜圖上的保留時(shí)間，即可得知樣品中單糖的絕對(duì)構(gòu)型。

色譜條件：色譜柱為Agilent Eclipse?XDB-C18（5 μm，4.6 μm×25.0 cm）;柱溫為35 ℃;檢測(cè)器為紫外檢測(cè)器（波長(zhǎng)250 nm）;流動(dòng)相為乙腈∶蒸餾水=25∶75（V∶V）;進(jìn)樣量為10 μL;流速為0.8 mL/min。

2 結(jié)果與討論

2.1 單糖組成分析

將高效液相色譜圖將松藻多糖的保留時(shí)間與多糖標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行比較，單糖組成百分比結(jié)果顯示：CP1主要由49.52%的阿拉伯糖和48.75%的半乳糖組成，另外含有1.73%的葡萄糖;CP2主要含有96.44%的半乳糖，還有3.56%的葡萄糖;CP3主要含有85.4%的葡萄糖，還有10.38%的半乳糖和4.22%的甘露糖。

2.2 單糖絕對(duì)構(gòu)型（D/L）的測(cè)定

采用高效液相色譜法測(cè)定多糖中主要單糖種類(lèi)的絕對(duì)構(gòu)型，僅適用于醛糖的測(cè)定。將單糖標(biāo)準(zhǔn)品和多糖樣品的液相色譜圖進(jìn)行對(duì)比，根據(jù)保留時(shí)間，結(jié)合單糖組成測(cè)定結(jié)果得出，CP1主要由阿拉伯糖和半乳糖組成，其絕對(duì)構(gòu)型分別是L-Ara和D-Gal;CP2主要由半乳糖組成，其絕對(duì)構(gòu)型為D-Gal;CP3主要由葡萄糖組成，其絕對(duì)構(gòu)型為D-Glc。

3 結(jié)語(yǔ)

本文對(duì)3個(gè)松藻多糖組分進(jìn)行單糖組成及單糖絕對(duì)構(gòu)型的測(cè)定，CP1主要由阿拉伯糖和半乳糖組成，其絕對(duì)構(gòu)型分別是L-Ara和D-Gal;CP2主要由半乳糖組成，其絕對(duì)構(gòu)型為D-Gal;CP3主要由葡萄糖組成，其絕對(duì)構(gòu)型為D-Glc。本方法所使用的配備紫外檢測(cè)器和C18反相色譜柱的高效液相色譜系統(tǒng)是現(xiàn)在實(shí)驗(yàn)室中常見(jiàn)的分析系統(tǒng)，簡(jiǎn)單易行。目前正在優(yōu)化反應(yīng)條件，以期能應(yīng)用于天然產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)測(cè)定。

參考文獻(xiàn)

[1]Tanaka T，Nakashima T，Ueda T，et al.Facile Discrimination of Aldose Enantiomers by Reversed-phase HPLC. Chemical & Pharmaceutical Bulletin，2007，55（6）：899-901.

基金項(xiàng)目：山東省高等學(xué)校科研發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目（編號(hào)：J18KA282）;煙臺(tái)職業(yè)學(xué)院校級(jí)課題（編號(hào)：2019001）。

作者簡(jiǎn)介：李娜（1987—），女，山東青島人，博士，講師。研究方向：海藻多糖。