消巖湯對人乳腺癌細胞MCF-7增殖的影響及機制

呂艷，張暢，李小江，鄭旭，韓燕燕，李翀，耿強，蘭福，趙杰

1 天津中醫藥大學第一附屬醫院，天津 300381；2 天津中醫藥大學

乳腺癌是全球最常見的女性惡性腫瘤之一，我國的乳腺癌發病率已居女性惡性腫瘤的首位[1]。消巖湯是基于扶正祛瘀的治則，依據現代藥理研制出的方劑，其以生黃芪、太子參為君藥，益氣滋陰，扶正驅邪；蛇舌草、夏枯草、生牡蠣為臣藥，清熱解毒，軟堅散結；郁金、姜黃為佐藥，活血祛瘀，行氣解郁；蜂房為使藥，搜剔經絡中之瘀毒。諸藥合用，共奏益氣滋陰、活血祛瘀、清熱解毒、扶正驅邪之功[2]。前期的基礎研究和臨床觀察證實，消巖湯具有抑制腫瘤細胞增殖和浸潤，改善患者生活質量的作用，通過調控Wnt通路，上調一系列通路相關的凋亡因子表達，從而抑制肺腺癌細胞的增殖和侵襲[3]。CCN5又稱Wnt誘導分泌蛋白2 (WISP-2)因子，能誘導腫瘤細胞凋亡，抑制腫瘤細胞增殖和轉移等，研究發現，CCN5通過調控S期激酶相關蛋白2(Skp2)/p27Kip1表達，抑制乳腺癌細胞增殖[4]。但CCN5受哪些因子調控，目前還不清楚。2018年7月～2019年12月，我們采用梯度濃度的消巖湯孵育乳腺癌細胞MCF-7，探索消巖湯調控CCN5、Skp2和p27Kip1抑制MCF-7細胞增殖的分子機制，并探尋消巖湯抑制MCF-7細胞增殖與消巖湯濃度和孵育時間的相關性。

1 材料與方法

1.1 材料 細胞株：人乳腺癌細胞系MCF-7細胞購于江蘇凱基生物技術股份有限公司。藥物：消巖湯顆粒劑為天津中醫藥大學第一附屬醫院院內制劑，由天津中醫藥大學第一附屬醫院藥廠提供。主要成分有黃芪、太子參、夏枯草、生牡蠣、白花蛇舌草、蜂房、姜黃和郁金。試劑：MTT細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒購于北京索萊寶生物科技有限公司。Western blotting相關試劑盒，RNA prep pure培養細胞總RNA提取試劑盒(離心柱型)、Fast King cDNA第一鏈合成試劑盒以及SYBR Green PCR試劑盒購于天根生化科技(北京)有限公司。

1.2 MCF-7細胞培養 用含10%滅活胎牛血清的DMEM、1×105U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素作為培養基，將MCF-7細胞置于含5% CO2、37 ℃細胞培養箱內培養，每3 d傳代1次。取對數生長期的細胞用于后續實驗。

1.3 消巖湯顆粒劑溶解液配制和溶解 稱取消巖湯顆粒劑0.27 mg，溶于3 mL PBS中，并在40 ℃水浴鍋中加熱溶解，生物安全柜紫外線照射15 min，并采用孔徑0.22 μm的無菌過濾器過濾溶解液，獲得濃度為0.09 μg/μL的消巖湯顆粒溶解液，倍比稀釋消巖湯顆粒劑溶解液，制成濃度分別為0.045、0.022 5 μg/μL的消巖湯顆粒劑溶解液。

1.4 消巖湯對MCF-7細胞增殖的影響觀察 采用MTT法。收集對數生長期MCF-7細胞，調整細胞懸液密度，分于96孔板，共18孔。每孔100 μL，每孔細胞數3 000～10 000個。5% CO2、37 ℃孵育箱中培養24 h后，分為消巖湯干預組和對照組。對照組加入100 μL 的DMEM培養基；消巖湯干預組加入100 μL消巖湯顆粒劑溶解液。5%CO2、37 ℃孵育箱中培養細胞24、36和48 h，進行MTT檢測。棄上清，每孔加入90 μL新鮮培養基，10 μL 的MTT，37 ℃孵育4 h后，棄上清，每孔加入110 μL Formazan溶液，置于低速搖床震蕩10 min，在酶聯免疫檢測儀處測量光密度值(OD值)。本實驗以細胞增殖抑制率衡量細胞增殖的快慢，細胞增殖抑制率=1-消巖湯干預組OD值/對照組OD值。OD值與細胞增殖呈正相關，即OD值越大，活細胞數量多，細胞增殖快，細胞增殖抑制率低；反之，OD值越小，活細胞數量少，細胞增殖越慢，細胞增殖抑制率越高。

1.5 CCN5及相關因子Skp2、p27Kip1 mRNA表達檢測 采用qRT-PCR法。用濃度為0.09 μg/μL消巖湯孵育MCF-7細胞48 h后，從培養細胞中提取總RNA，測定濃度，計算gDNA反應體系中所需的RNA量，首先進行gDNA去除反應，反應體系如下：5×gDNA Buffer 2 μL，Total RNA 3 μL，RNase-Free ddH2O補足至10 μL，反應條件：42 ℃ 3 min，隨后置于冰上。然后進行逆轉錄反應，體系如下： 10×King RT Buffer 2 μL, Fast King RT Enzyme Mix 1 μL，FQ-RT Primer Mix 2 μL，RNase-Free ddH2O 補足至10 μL，并與gDNA去除反應體系混合，形成20 μL反應體系。PCR反應體系如下：SYBR Premix Ex Taq Ⅱ(Tli RNaseH Plus)(2×)12.5 μL，Primer F (10 μmol/L) 1 μL；Primer R (10 μmol/L) 1 μL，cDNA 2 μL，dH2O 8.5 μL，反應體系25 μL。反應條件：95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，40 個循環；60 ℃ 30 s。選擇β-actin作為內參。引物序列如下：CCN5正向引物：5′-CTGGGCTGATGGAAGATGGT-3′，反向引物：5′-TGTGTGTGTAGGCAGGGAGTG-3′;Skp2正向引物：5′-ATGGACCAACCATTGGCTGAA-3′,反向引物：5′-ACACTGAGACAGTATGCCGTGGAG-3′;p27Kip1正向引物：5′-CAAATGCCGGTTCTGTGGAG-3′,反向引物：5′-TCCATTCCATGAAGTCAGCGATA-3′。

1.6 CCN5及相關因子Skp2、p27Kip1蛋白表達檢測 采用Western blotting法。用濃度為0.09 μg/μL的消巖湯孵育MCF-7細胞48 h后，以含0.25%胰蛋白酶消化收集細胞，紅細胞計數法計數細胞濃度，每1×107細胞加入1 mL蛋白裂解液PMSF裂解細胞，轉移至1.5 mL EP管中，顛倒裂解20～30 min。4 ℃ 12 000 r/min離心15 min，取上清液，測蛋白濃度后，每個樣品蛋白終濃度均調整為2 μg/μL，-80 ℃ 保存備用。將定量后的蛋白質100 ℃加熱5 min后上樣、電泳，經15% SDS-PAGE電泳后轉PVDF膜 90 min，用1 mL一抗(CCN5、Skp2、p27Kip1稀釋比例分別為1∶1 000、1∶500、1∶150)，4 ℃ 封閉過夜，棄一抗后加入1 mL辣根過氧化物酶標記二抗(稀釋1∶500)，室溫孵育2 h后漂洗，發光液顯影、成像。以β-actin作為內參。目標蛋白相對表達量=目標蛋白灰度值/β-actin灰度值。

2 結果

2.1 消巖湯對MCF-7細胞增殖的影響 對相同濃度的消巖湯，隨著孵育時間的增加，細胞增殖受到抑制的程度提升。在消巖湯孵育時間一定的情況下，隨著藥物濃度的增加，細胞增殖逐漸受到抑制。消炎湯對CCN5基因敲降的MCF-7細胞增殖有抑制作用，抑制程度與消巖湯濃度和孵育時間相關。MTT實驗結果顯示，消巖湯藥物濃度一定的條件下，MCF-7細胞增殖抑制率隨著藥物孵育時間的增加而升高。高濃度0.09 μg/μL消巖湯孵育MCF-7細胞48 h的細胞增殖抑制率高于孵育24 h(P<0.05)。中濃度0.045 μg/μL的消巖湯，孵育36 h的細胞增殖抑制率高于24 h，低于48 h，但差異無統計學意義(P>0.05)。低濃度0.022 5 μg/μL的消巖湯，孵育48 h高于36 h及24 h的細胞增殖抑制率，36 h高于24 h，但差異無統計學意義(P均>0.05)。消巖湯孵育時間一定的條件下，MCF-7細胞增殖抑制率隨著藥物濃度的增加而逐漸升高。孵育48 h時，高濃度(0.09 μg/μL)消巖湯干預后的細胞增殖抑制率高于低濃度(0.022 5 μg/μL)消巖湯干預(P<0.05)。孵育24 h時，低濃度與中濃度、高濃度消巖湯間的細胞增殖抑制率有一定差異，但無統計學意義(P均>0.05)。同樣，孵育時間36 h時，隨著消巖湯藥物濃度增加，細胞增殖抑制率逐漸上升，但差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 梯度濃度消巖湯孵育MCF-7細胞不同時點細胞增殖活力比較(OD值,

2.2 兩組CCN5、Skp2和p27Kip1 mRNA表達比較 高濃度(0.09 μg/μL)消巖湯孵育MCF-7細胞48 h時，消巖湯干預組CCN5 mRNA相對表達量高于對照組(P<0.05)，Skp2 mRNA相對表達量低于對照組(P<0.05)，p27Kip1 mRNA相對表達量高于對照組(P<0.05)。見表2。

表2 兩組CCN5、Skp2和p27Kip1 mRNA相對表達量比較

2.3 兩組CCN5、Skp2和p27Kip1蛋白表達比較 與對照組相比，消巖湯干預組的CCN5蛋白電泳條帶灰度較深，Skp2蛋白電泳條帶灰度較淺，p27Kip1蛋白電泳條帶較深。蛋白電泳圖灰度分析(圖1)結果顯示，消巖湯干預組CCN5蛋白相對表達量高于對照組(P<0.05)，Skp2蛋白相對表達量低于對照組(P<0.05)，p27Kip1蛋白相對表達量高于對照組(P<0.05)。見表3。

注：1為對照組；2為消巖湯干預組。

圖1 高濃度消巖湯干預MCF-7細胞Western blotting電泳圖

表3 兩組CCN5、Skp2和p27Kip1蛋白相對表達量比較

3 討論

中醫藥治療乳腺癌的觀念是從機體整體出發，扶正祛邪，解毒祛瘀，消腫散結，從而實現 “減毒增效”，在乳腺癌綜合治療中有重要的地位和作用。中醫理論認為，正虛為癌瘤發病之根本，毒瘀并存是癌瘤發生的關鍵因素，治療乳腺癌應扶正與祛邪相結合，在扶正的基礎上解毒祛瘀。消巖湯是在“解毒祛瘀，扶正抗癌”治則基礎上，依據現代藥理研究研制出的中藥制劑，消巖湯能有效抑制肺腺癌細胞增殖，從而達到改善患者生存質量、延長生存期的臨床療效，與相應的化療藥物聯用于肺腺癌患者，可起到“減毒增效”的協同作用。消巖湯對肺腺癌細胞A549增殖有顯著抑制增殖和凋亡作用[5]，并對骨髓造血微環境具有改善作用，促進骨髓造血[6]。與本研究內容更為密切的一項臨床觀察結果顯示，消巖湯不但可顯著減輕乳腺癌的化療不良反應和腫瘤標志物CA153水平，且能顯著改善患者的生存質量，如體質量增加和免疫細胞數量提升[7]等。

從我們的實驗結果來看，消巖湯對乳腺癌細胞增殖具有抑制作用，且抑制作用與消巖湯濃度和MCF-7孵育時間呈正相關，如高濃度消巖湯孵育細胞時間越長，MCF-7細胞增殖抑制率越高，并對CCN5、Skp2和p27Kip1等增殖相關的調控因子均有影響。

高濃度消巖湯孵育48 h的MCF-7細胞增殖抑制率高于孵育24 h，差異有統計學意義。當兩組MCF-7細胞均孵育48 h，消巖湯干預組高濃度的細胞增殖抑制率高于低濃度，差異有統計學意義。可見較高濃度的消巖湯對MCF-7細胞增殖有較大程度的抑制作用，抑制程度與消巖湯的濃度和細胞孵育時間呈正相關。

本研究qRT-PCR結果顯示，消巖湯通過上調CCN5 mRNA模板量，從而下調Skp2轉錄模板量，隨后造成p27Kip1轉錄上調，抑制乳腺癌細胞增殖。此外，Western blotting結果表明，消巖湯通過提高CCN5蛋白表達量，從而降低Skp2表達，p27Kip1蛋白表達上調，抑制乳腺癌細胞增殖。可見，消巖湯在轉錄和蛋白水平抑制CCN5表達，從而調節Skp2和p27Kip1在相應水平的表達。

CCN5基因作為抑癌基因，與Wnt通路關系密切。研究發現，CCN5作為Wnt通路中的一個調控因子，在抑制胃癌進展過程中發揮重要作用[8]，有學者更深入的研究后發現，消巖湯通過介導Wnt通路相關調控因子，上調一系列凋亡相關蛋白的表達，發揮抑制肺癌細胞增殖和侵襲的作用[3]，CCN5抑制食管癌細胞增殖、侵襲進一步強調了該基因與消化系統腫瘤發生的密切聯系[9]。CCN5表達與乳腺癌激素受體的相關性研究，提示了CCN5表達與乳腺癌的發生和進展有關，推測該基因可作為早期乳腺癌的監測基因[10]。以上文獻研究結果表明，CCN5在抑制惡性腫瘤發生和進展這一諸多基因參與調控的復雜過程中，占有重要一席之地。

另外，值得一提的是與CCN5基因下游調控相關的兩個因子——Skp2和p27Kip1。Skp2作為細胞分裂增殖的促進因子，通過對多種細胞周期抑制蛋白的泛素化、降解[11,12]，與細胞周期調控及腫瘤的發生發展，甚至腫瘤預后關系密切[13,14]。所以，本研究在細胞水平證實，消巖湯通過調控CCN5、Skp2和p27Kip1的轉錄和蛋白表達調節乳腺癌細胞增殖，并且這種調節與消巖湯藥物濃度和孵育時間有一定程度的相關性。

研究發現，CCN5通過影響Skp2/p27Kip1表達，對三陰性乳腺癌的增殖產生抑制作用[4]，此項研究對象是激素受體表達缺失的乳腺癌，并未將激素作用納入到對CCN5調控的影響中，然而，有研究證明，激素調節在乳腺癌細胞增殖中有重要作用[15,16]。我們的研究是以激素受體陽性的細胞系——MCF-7細胞作為研究對象，結果顯示消巖湯可抑制人乳腺癌細胞MCF-7細胞增殖，其機制可能通過上調CCN5表達，抑制Skp2表達和上調p27Kip1表達實現。