miRNA、TGF-β信號通路及EMT過程對乳腺癌調控作用的研究進展

劉博文，潘麗慧，曹旭晨

天津醫科大學腫瘤醫院乳腺腫瘤一科,國家腫瘤臨床醫學研究中心,天津市腫瘤防治重點實驗室,天津市惡性腫瘤臨床醫學研究中心,乳腺癌防治教育部重點實驗室,天津300060

乳腺癌是全世界女性最常見的惡性腫瘤，術后出現的治療抵抗、復發及轉移是我們面臨的主要挑戰[1]，因此深入了解其調控機制有重要意義。miRNA是一類內源性、高度保守的短鏈非編碼RNA，其對基因表達有負調控作用，部分miRNA還可作為轉化生長因子-β(TGF-β)/Smad信號通路的下游信號分子發揮作用。上皮—間充質轉化(EMT)可介導腫瘤轉移，在腫瘤的惡性轉化中起重要作用，但該過程受TGF-β/Smad信號通路所調控。此外，有研究表明miRNA、TGF-β相關信號通路及EMT過程在乳腺癌細胞的干性調控中亦發揮重要作用[2,3]。現對miRNA、TGF-β信號通路及EMT過程在乳腺癌細胞及其干性、腫瘤微環境中的相互調控作用綜述如下。

1 miRNA 對乳腺癌的調控作用

miRNA是小的非編碼單鏈RNA，長為19～25個核苷酸，最新的miRBase數據庫已注冊了1193個小鼠miRNA基因和1881個人類的miRNA基因。經嚴格篩選，小鼠和人體內確定的標準miRNA基因數量分別為475和519。miRNA對其靶mRNA的識別主要通過miRNA與靶mRNA的3′-非翻譯區(3′-UTR)的互補序列結合來介導。有研究表明，miRNA可在組織發育中呈差異性和暫時性表達[4]。在腫瘤學研究中，有學者發現，不同的miRNA特征可準確分辨腫瘤和腫瘤的不同亞型[5]。此外，miRNAs還可作為腫瘤診斷和治療的候選標志物，耿淼等[6]研究發現，低表達 Let-7g 的三陰性乳腺癌(TNBC)患者預后更差，提示Let-7g可作為TNBC患者治療和預后評價潛在的分子靶點。據報道，諸多miRNA可抑制不同的腫瘤相關基因，即扮演癌基因和抑癌基因的角色[7]。如miRNA-29在乳腺癌中因可通過抑制抑癌基因DNA甲基化，被證明是一種抑癌因子，從而導致癌細胞增殖減少和藥物敏感性增加[8]。而Liu等[9]證明，miRNA-29b的表達促進了人乳腺癌細胞的遷移和侵襲，miRNA-29b基因具有靶向腫瘤抑制因子 PTEN的能力。換言之，miRNA-29在乳腺癌的發生發展中既是抑癌因子亦是促癌因子。

2 TGF-β信號通路對乳腺癌的調控作用

TGF-β家族由三種TGF-β亞型、激活素、抑制素、骨形成蛋白(BMPs)、生長和分化因子組成。大致可分為TGF-β/Activin/Nodal和BMP/GDF/MIS兩個亞家族。具有調節癌細胞增殖、分化、遷移、黏附、凋亡、胚胎發育、胞外基質形成、骨的形成和重建等重要作用[10]。TGF-β家族的配體與兩種絲氨酸—蘇氨酸激酶受體(Ⅱ型和Ⅰ型受體:TβR-Ⅱ和TβR-Ⅰ)結合后，特異性復合物被激活以傳導下游信號。TGF-β可激活Smad依賴的信號傳導通路，其中TGF-β亞型和激活素可觸發Smad2和Smad3的磷酸化(激活素/TGF-β特異性R-Smads)。BMP可觸發Smad1、Smad5和Smad8的磷酸化(BMP特異性R-Smads)。此外TGF-β還可激活幾種Smad非依賴的信號傳導途徑，如PI3K-Akt信號通路和MAPK通路等非Smad信號通路。TGF-β在腫瘤發生發展中的作用主要體現在以下方面[11]：①生長調節，特別是在腫瘤發生的早期階段擺脫TGF-β的生長抑制；②在腫瘤微環境中通過TGF-β增強細胞外基質的合成和纖維化；③通過TGF-β促進EMT和(或)轉移；④腫瘤微環境的免疫抑制作用。TGF-β在乳腺癌中扮演雙重角色，其不僅是一種抑癌因子，還可促進乳腺癌的浸潤及轉移。TGF-β2失活提高了癌前病變或分化較高的乳腺癌細胞侵襲力，但亦下調了分化較差惡性程度較高的乳腺癌細胞的轉移能力[12]。

3 EMT過程對乳腺癌的調控作用

腫瘤細胞的EMT是指由極化的穩定的上皮細胞轉變為不穩定的間充質細胞，從而使其侵襲轉移能力增強。這種轉化的特征是降低促進細胞之間接觸蛋白質(如E-鈣黏蛋白和γ-連環蛋白)的表達，增強間充質標志物(如波形蛋白，N-鈣黏蛋白和纖維粘連蛋白)的表達，同時亦可增強部分基質金屬蛋白酶的活性。EMT可分為發育型(Ⅰ型)、纖維化和傷口愈合型(Ⅱ型)和腫瘤型(Ⅲ型)。最新研究表明，EMT在腫瘤侵襲和轉移中起關鍵作用，EMT能使腫瘤細胞發生早期轉移，發生EMT的腫瘤細胞可脫離原發腫瘤，穿過基底膜進入循環外周血，然后再逆轉為上皮表型并形成腫瘤的遠處轉移病灶[13]。既往研究不斷肯定腫瘤微環境(TME)在調節腫瘤細胞EMT中的重要性，如缺氧、細胞外基質組成的改變及其生物學特性亦決定了腫瘤細胞對TGF-β的反應及其驅動EMT過程和轉移進展的能力[14]。有研究表明，EMT相關基因的表達與基底樣型乳腺癌相關，包括轉錄因子FOXC2等。基底樣型乳腺癌遠處轉移能力強、預后差，高表達EMT相關蛋白(波形蛋白、僅平滑肌肌動蛋白、N-鈣黏蛋白、鈣黏蛋白-1 )、層黏連蛋白、肌成束蛋白，低表達E-鈣黏蛋白[15]。

4 乳腺癌中miRNA、TGF-β信號通路及EMT過程的相互調節機制

有研究證實，miRNA可通過靶向TGF-β信號傳導途徑的下游靶點，在多個水平調控TGF-β信號[16]。目前在腫瘤中已發現了多種靶向TGF-β受體的miRNA，包括miR-21、miR-17/92、miR-106b、miR-211及miR-590等[17]。反過來，TGF-β/BMP信號傳導通路可調控多種miRNA，從而形成反饋調節。如TGF-β信號傳導途徑可上調miR-21、miR-181、miR-10b、miR-17/92、miR-155、miR-192、mir-23/24/27、miR-216/217、miR-494和miR-182的表達[16]；下調miR-200、miR-203、let-7、miR-34a和miR-584的表達[18]。國內外多項研究表明，部分miRNAs可直接靶向EMT轉錄因子從而調控EMT。如miR-205和miR-200協同作用可通過抑制ZEB從而抑制EMT[19]。有部分miRNA通過靶向細胞結構組分調節EMT。CDH1是調節腫瘤上皮細胞之間黏附、運動的鈣依賴蛋白，在人類乳腺癌細胞中，miR-194的過表達可直接抑制CDH1從而抑制EMT過程。

TGF-β、血小板源性生長因子(PDGF)、成纖維細胞生長因子(FGF)、NF-κB、Wnt、Notch和hedgehog蛋白等信號通路及重要因子可直接或間接促進Snail、ZEB1/2和NF-κB等轉錄因子的表達，抑制細胞上皮表型的基因表達，促進EMT，我們將這些轉錄因子稱為“EMT的激活劑”[20]。如TGF-β與其受體(TGF-βRⅠ、TGF-βRⅡ和TGF-βRⅢ)相結合后會使Smad 2和Smad3磷酸化，并與Smad4形成復合體，之后該復合體轉入核內，在核內進一步調控TGF-β靶基因及其他DNA結合因子的表達，如Snail、ZEB和 Twist基因等,結果造成上皮標志物表達下調及間充質標志物表達上調[21]。Zhang等[22]在前期研究中發現,FAM64A可促進乳腺癌的EMT過程，進而促進細胞的侵襲及運動，同時在乳腺癌細胞干性的維持中也發揮著重要作用，但FAM64A對EMT的具體調控機制需要進一步研究。TGF-β誘導EMT的具體過程可分為兩步，第一步，上皮細胞轉化為部分EMT狀態，同時SNAIL-miR-34雙穩態開關被激活，這導致E-鈣黏蛋白的表達降低和波形蛋白的表達增加。第二步，細胞從部分EMT狀態轉變為間充質狀態，并且ZEB1-miR-200雙穩態開關被激活，這導致E-鈣黏蛋白的表達降低和波形蛋白的表達增加[23]。

5 miRNA、TGF-β信號通路及EMT過程在乳腺癌微環境調節中的作用

miRNA不僅可調節腫瘤細胞的特性，還可調節腫瘤微環境從而促進腫瘤細胞轉移、治療抵抗及免疫抑制[24]。癌細胞中miRNAs改變可通過改變癌細胞分泌的因子產生對癌細胞有利的微環境，TGF-β能上調miR-21和miR-155來促進MDSCs的產生[25]。有學者提出TGF-β相關的miRNAs可調節TGF-β誘導的癌癥相關成纖維細胞的形成， TGF-β誘導型miR-21可靶向Smad7并潛在促進TGF-β誘導的腫瘤形成[26]。TGF-β通過抑制成纖維細胞的活性而抑制腫瘤細胞的活性，腫瘤相關成纖維細胞中TGF-β信號通路的喪失能夠促使驅動腫瘤形成和轉移進展的微環境因子的產生。在乳腺成纖維細胞中選擇性刪除TβR-Ⅱ基因表達后也可觀察到乳腺癌形成，其機制是通過增加成纖維細胞分泌的細胞因子和生長因子(如TGF-β、MSP和HGF)來改變細胞外基質的生物學特點，從而增強乳腺癌細胞的增殖和侵襲。

整合素是有致癌效應的TGF-β信號傳導的突出介質及并且其與EMT密切相關。整合素是將細胞外基質與肌動蛋白細胞骨架系統連接起來的跨膜支架，它們還可作為機械轉導的介質，調節細胞增殖、遷移和侵襲。其中，整合素對TGF-β反應性的表達上調對于EMT至關重要。整聯蛋白通過FAK橋接與TβR-Ⅱ形成復合物，導致Src介導的Tyr284的TβR-Ⅱ磷酸化，后者可募集將TGF-β與p38MAPK的擴增活化相耦合所必需的ShcA和Grb2[27]。抑制這些關鍵因子可抑制致癌的TGF-β信號傳導，包括其與NF-κB、Cox-2和PGE2信號途徑的偶聯，以及阻止TGF-β驅動的EMT和轉移表型的獲得。TGF-β信號通路還受其與整合素的物理相互作用的影響，整合素亦可調節EMT過程及p38 MAPK信號通路中的TGF-β的激活。最近，國內外專家學者將EMT中的TGF-β刺激與播散性乳腺癌細胞增殖及轉移相聯系，改變TGF-β激活Smad4的復雜的腫瘤微環境，從而阻斷Pyk2(可介導癌細胞轉移性休眠的逃逸)的表達[28]。但這些受E-cadherin和整合素的“倒數式”表達模式的控制，休眠細胞通常是E-鈣黏蛋白高表達，整合素低表達，而成熟細胞通常是整合素高表達，E-鈣黏蛋白低表達[29]。更為重要的是，EMT表型的獲得代表了分子開關允許細胞在轉移性休眠和生長之間切換，這是由于E-鈣黏蛋白表達減少，其以異型方式與整聯蛋白的細胞外結構域相互作用，導致整合素和Pyk2介導轉移失活。最后，我們將“整聯蛋白轉換”定義為TGF-β致癌活性的新型調節劑。

6 miRNA、TGF-β信號通路及EMT過程在乳腺癌干細胞(CSCs)調控中的作用

CSCs是指像干細胞一樣有自我更新分化能力的腫瘤細胞。但它們是否能分化成不同類型的細胞還存在爭議。程騰等[30]通過構建乳腺癌干細胞裸鼠移植瘤模型發現，miR-429可降低乳腺癌干細胞的干性和體內成瘤能力,其可能是抑制乳腺癌轉移和耐藥的關鍵分子。研究表明，TGF-β在多種腫瘤中發現與化療后腫瘤干細胞富集所引起的化療耐藥有關[31]。隨后的研究表明，同樣產生的EMT后細胞群也可呈現處某些間充質干細胞的特征。

綜上所述，乳腺癌中miRNA、TGF-β、EMT間相互聯系，三者對乳腺癌微環境及CSCs均有調控作用，它們間的聯系是一個復雜的、嚴密調控的網絡，其中CSCs是乳腺癌復發和轉移的重要原因，亦是乳腺癌患者的主要死亡原因。因此深入了解各調控機制、發現新的miRNA功能及針對乳腺癌干細胞進行個體化治療將會為乳腺癌的診斷、治療及預后改善帶來新的進展。