關于糧油檢驗中標準曲線問題的探討

單非

摘 要：糧食中藥殘、金屬元素、添加劑、真菌毒素檢驗中涉及大量色譜、光譜分析方法，正確理解把握標準曲線是糧食檢驗的薄弱環節，根據日常檢驗實踐的積累，對工作中常見問題進行探討和總結。

關鍵詞：糧油檢驗;標準曲線;制作;檢驗;使用

中圖分類號：TS210 文獻標識碼：A 文章編號：1671-2064（2020）06-0065-02

糧食質量安全是糧食安全的重要組成部分，加強糧食質量檢驗基礎工作和提高糧油檢驗員業務技術能力是行業發展的需要，是貫徹中國好糧油行動的具體體現。多年來，基層糧食檢驗機構和企業對糧油的感官檢驗、物理檢驗和常規化學檢驗掌握較準確，實踐積累多，而在藥殘、金屬元素、添加劑、真菌毒素等需使用色譜、光譜、質譜類儀器上則存在儲多問題，“檢得慢、檢不出、檢不準”等問題突出。尤其在標準曲線的制作、檢驗、運用上存在許多問題和誤區，直接導致檢驗結果出現偏差，甚至嚴重失真。筆者總結多年來從事糧食檢驗的經歷，就在糧油檢驗中使用標準曲線經常見到和碰到的問題或者疑惑進行粗淺的討論。

1糧食檢驗標準曲線的本質

我們糧油分析檢驗的首要任務是定性和定量，定性可以說是有和無的問題，定量是提供待測物質含量范圍的一個過程，這當中包含了任何定性定量都有不確定度的含義。而普遍采用的標準曲線是糧食日常理化分析和檢驗中的日常性工作。糧油檢驗中的標準曲線可定義為：一系列已知含量（濃度）的物質的量值與儀器響應（儀器的峰高或峰面積）之間的關系，即一系列經過確認的濃度梯度在儀器上的信號反映。通過建立數學模型，處理后就得到方程，方程的圖形化表示就是我們所說的標準曲線。糧油檢驗中，得到的標準曲線的作用是什么呢？就是使用標準曲線查出被測物質的含量（濃度）。我們在日常檢驗中通常是這樣做的，首先我們拿出一系列已知含量的物質（或組分），進樣后得到一組與含量對應的儀器信號值，信號值與被測物的含量存在的對應關系，就是一種函數關系。在數學上我們叫做曲線擬合，顯而易見，直線最簡單，因此，采用直線方程進行擬合是我們最常用的一種方式。當然，個別時候也用到多項式擬合等形式。

2糧食檢驗標準曲線的制作

2.1糧油檢驗中常見錯誤做法

實際檢驗中，由于理論標準知識欠缺或操作不嚴謹，常出現以下情況：

（1）減少標準樣品點。經常發現一些檢驗員為實現相關系數R值合格或減小工作量，人為減少標準點;（2）被測量值已超出標準曲線的濃度范圍仍使用標準曲線，或者被測量值在曲線的低點（高點）時仍使用;（3）曲線相關系數R值不符合要求，照樣使用標準曲線。

2.2制作標準曲線的規則

那么，標準曲線到底應該怎么做呢，是有明確標準規定的。國家標準GB/T22554-2010《基于標準樣品的線性校準》中進行了以下基本原則的規定：

（1）標準曲線都有一定的濃度范圍，被測物質一般也有一定的測量范圍，一定要保證兩個范圍相互匹配，如不匹配，則需對標準濃度系列或被測物濃度進行調整;（2）標準品與被測樣品在組分構成上要盡量保持一致以減小干擾;（3）標準品的濃度值盡量等距分布在曲線范圍內;（4）標準品的每個濃度點要至少重復2次，并且要從前處理（稀釋）開始;（5）標準樣品至少要有3個濃度梯度。

實際檢驗中，我們糧食國家方法標準中大部分列有標準濃度系列，盡量按標準規定去做。如果檢驗任務重或檢驗項目比較有把握時，想要適當減少標準濃度點，則需要我們有理論的支持，同時最好有實踐的確證。無論如何，至少要有3個濃度梯度是最低標準。常規檢驗工作中我們經常采用線性校準，主要是線性方程更為簡單。

3糧食檢驗標準曲線的檢驗

糧食標準曲線的檢驗，是標準曲線應用很重要的一個方面，但同時也是我們糧油實際檢驗操作中不容易理解和掌握的地方，針對此問題的爭論也是最多的。

（1）標準曲線的線性檢驗：其實是校準曲線的精密度檢驗。一般對于多個被測物濃度梯度所獲得的響應峰高或峰面積值制作的校準曲線，通常要求相關系數|r|≥0.9990，如果達不到此水平，則需要查找原因，并給予糾正，重新制作合格校準曲線。標準曲線的線性（精密度）檢驗，實際上真正含義就是：我們檢驗測得的若干個濃度點，在我們擬合成的直線方程上下左右的分布狀態。標準曲線的擬合，數學上的原理是曲線上所有點以最小二乘法（OLS）擬合，曲線到所有點的垂直距離的和為最小。通過原理可以看出，標準曲線在實際上不是必須通過全部濃度點，而是從總體上更接近全部濃度點。因此，線性檢驗實際上就是看這些測試點與擬合直線的距離，確認是否出現了異常狀態。

（2）標準曲線的截距檢驗：這是一種校準曲線準確度的檢驗。線性檢驗如果合格，則對標準曲線進行線性回歸，從而取得回歸方程y=a+bx，然后進行相應t檢驗。一般取95%置信水平，如無顯著性差異，則a可做0處理，方程簡化為y=bx，即x=y/b。通過簡化處理后，在一定方程線性范圍內，我們可以用此方程直接替代校準曲線。這種情況下，樣品測量的峰高或者峰面積值經校正空白后，就可以直接計算出試樣濃度。如果存在顯著性差異，則是表明所得曲線的回歸方程準確度不是很高。這時，要找出原因予以校正。

無論何時，我們所得曲線方程不經過以上的檢驗和相應校正，直接用于我們檢驗結果的計算，必將給測定結果帶來偏差，甚至嚴重影響結果的可信度。

（3）標準曲線的斜率檢驗：這其實是對分析方法靈敏度的檢驗。我們知道，分析方法的靈敏度和實驗條件是相關的，會隨著實驗條件的變化而變化。如果在完全相同的分析實驗條件下，只是隨機誤差導致的斜率變化，一般不會超出一定范圍，這個范圍只是由于分析方法的精度不同造成的。例如，糧食重金屬檢驗中原子吸收分光光度法國家標準一般要求結果相對差值小于10%等。

4糧食檢驗標準曲線常見問題的探討

4.1每次實驗是否都要做標準曲線

無論色譜還是光譜類儀器，由于每天所配的流動相都會有所不同，檢測器能量也在不斷的衰弱過程中，會導致出峰時間、峰面積等相應都有所差異。因此，條件允許情況下，建議每次均做標準曲線。特別是現在儀器均配備多位數自動進樣系統，節省時間和人力，檢驗人員能夠承受此工作量。

如果檢測項目屬于長期連續檢測，儀器狀態穩定，可以采用標準品進行定位與定量的方式進行曲線確認。比如在樣品鉛檢測分析時，可在實驗時選擇測定兩個標準濃度點（如5?g/L，20?g/L），若測得兩個標準濃度點的響應值與原標準曲線相應點的相對偏差均小于5%時，那么原校準曲線仍可使用。或者采用每批樣品測定一個校準曲線中間點濃度的標準液，其測定濃度與校準曲線標準點的濃度相對誤差不超過規定范圍也可。特別需注意的是，檢測項目不同，分析測試方法不同，校準曲線斜率的穩定性是不同的，采用上述方法的前提中校準曲線的斜率較為穩定。

4.2曲線相關系數有效數字保留問題

國家標準GB5750.3-20068.2.7項規定如下：相關系數只舍不入，保留到小數點后出現非9的一位，如0.999987→0.99998。如果小數點后出現許多位9時，最多保留小數點后4位，即0.9999。

4.3糧食檢驗標準曲線是否必須過原點

標準曲線不一定非要過原點，只要線性好就可以了。因為做空白的話基本上不會過原點。從原點（0，0）代表的意義來考慮，即所測組分濃度為零的時候，信號響應值（峰高或峰面積）是否也為零。理論上色譜分析可以，而光譜分析就講不通了，濃度為零的標準溶液（本底）響應信號（吸光度）往往不是零。

4.4檢驗中空白測出負值怎么辦

空白的意義，是代表我們實驗中選擇的空白（試劑、器皿等）對儀器響應/信號的影響，有此時候是正方向的，也可能是負方向的，從理論上講，必須減掉空白。

4.5濃度法還是體積法進樣哪個更適合糧食檢驗標準曲線

一般我們制作標準系列時，是配制不同濃度，進樣相同體積，大部分糧食國家方法標準也采用此法，這即是濃度法進樣。個別時候，也可能會用到同一濃度不同體積來進樣，稱為體積法進樣，并不太常見。濃度法進樣時溶劑的環境（體積）是一致的，可以想像這樣在判斷溶劑（或溶劑中干擾物質）和被測物質更加容易，更好確認。體積法進樣中我們可以想到，干擾物質可能會隨標準系列的變化而變化，實現待測物質的確認就會受到干擾。還有一點就是小體積進樣時不確定度會較大。因此，與濃度法進樣相比，體積法要得到理想的標準曲線可能會更難，做不好，對結果的影響是巨大的。另外還有一個問題，就時進樣系統物理體積的限制問題，較大跨度的濃度系列使用體積法進樣是不太容易實現的。通過兩種進樣方式的比較論述可以看出，濃度法進樣具有更多優點，比如更容易做出理想的標準曲線，更容易實現較大濃度跨度的進樣，更容易實現待測物質的確認等。基于濃度進樣法的以上優勢，我們糧油檢驗標準曲線制作還是建議使用濃度進樣法。

4.6樣品是負值時，結果怎么確定

日常檢驗中，經常會出現根據標準曲線計算樣品檢測為負值的情況，我們一般選擇這樣幾種方式確認和報告結果：未檢出，低于檢出限，低于定量限，低于標準曲線第一點的樣品濃度。一般來說，以上幾種確認和報告結果的方式都可以采用，實際區別是四種選擇下面的風險是不一樣的。

報告未檢出時，要加入界定語描述，如“本實驗室、本儀器、本方法未檢出”等。如果不體現這些具體的界定語描述，僅“未檢出”的結果報出，歧義就很大很多。

檢出限（LOD）是我們進行某種組分檢測時定性檢出的標志，它一般是和空白統計比較后，計算出來的。通常檢出限用基質空白所產生的儀器背景信號的3倍值的相應量，或者以基質空白產生的背景信號平均值加上3倍的均數標準差來確定。

定量限（LQD）是可以定量檢出的標志，其RSD定為10%，定義為樣品中被測物能被定量測定的最低量，現實檢驗中要求其測定結果應具有一定的準確度。定量限的意義主要是體現了實驗分析方法是否具有較好的定量檢測能力。

標準曲線第一點的樣品濃度值，可以理解為是我們比較可信的儀器測定值。低于第一點的樣品濃度值，則其可信度就會有疑問，值得懷疑。

總之，報告“低于檢出限，低于定量限，低于標準曲線第一點的樣品濃度”，風險依次降低。如果國標方法中明確了檢出限或定量限，推薦直接報告小于國家標準規定的限值。

正確理解和使用標準曲線，是當前糧油檢驗專業技術人員開展檢驗工作的基礎。隨著糧食檢驗由簡單的物理檢驗向成分分析、污染物監測、添加劑的檢驗、新產品開發等領域的拓展，標準曲線的應用越來越普及。因此，根據日常檢驗實際，做以探討交流。