探討低劑量地西他濱對CD4陽性T細胞功能的影響

韓 笑，郭業磊，代漢仁，佟 川，陳德云，王 瑤，韓為東

解放軍總醫院第一醫學中心 生物治療病區/分子免疫室，北京 100853

長期以來基因組突變一直被認為是腫瘤形成的核心因素，但是近些年的研究表明，表觀遺傳機制在腫瘤疾病的進展中同樣發揮了重要的作用[1]。DNA甲基化、組蛋白修飾以及非編碼RNA調節等是表觀遺傳修飾的主要機制，因此靶向或逆轉表觀遺傳修飾已經成為了極具潛力的腫瘤治療方法[2-3]。其中DNA甲基轉移酶抑制劑(DNA methyltransferase inhibitor，DNMTi)能夠發揮對DNMTs抑制的表觀遺傳效應而產生抗腫瘤作用。雖然DNMTi對腫瘤抑制基因重新激活的研究更為廣泛，但有證據表明DNMTs的抑制會產生腫瘤細胞外的免疫調節作用。去甲基化修飾對于T細胞的耗竭至關重要，其能夠抑制耗竭T細胞中效應細胞功能、增殖、代謝活性和組織歸巢所涉及的關鍵基因[4-6]。最新研究也證實DNA甲基化促進了T細胞耗竭并限制了PD-1抑制劑的療效，而DNA去甲基化則增強了PD-1抑制劑介導的T細胞再生[7]。目前有關DNMTi的研究更多集中在腫瘤細胞、T細胞以及CD8陽性T細胞亞群，對CD4陽性T細胞的研究報道較少[8-10]。去甲基化藥物地西他濱(5-氮雜-2'-脫氧胞嘧啶核苷；decitabine，DAC)是一種獨特的胞嘧啶類似物，能抑制DNA甲基轉移酶，逆轉甲基化，并能在體內和體外重新激活表觀遺傳沉默的基因[11-12]。本研究采用體外添加DAC對CD4陽性T細胞進行修飾，觀察其對CD4陽性T細胞增殖、記憶以及細胞毒性的影響，為地西他濱增強CD4陽性T細胞抗腫瘤功能的研究提供探索方向。

材料與方法

1 實驗細胞 Raji細胞(人Burkitt's淋巴瘤細胞系，美國ATCC)。

2 主要試劑和儀器 PBS緩沖液，Buffer緩沖液(PBS+0.5%人血清白蛋白+2 mmol/L EDTA)，人外周血淋巴細胞分離液，X-VIVO15培養基(瑞士 Lonza)，IL-2(美國 PeproTech)，CD3單克隆抗體(日本Takara)，磁力分選柱，人類CD4+T細胞磁珠分選試劑盒(德國Miltenyi)，人IL-2、FasL、IFN-γ以及TNF-αValukineTMELISA試劑盒(美國NOVUS)，流式細胞抗體CD3-APC、CD4-FITC、CD8-PerCP、CD45RO-APC、CD62L-PE，醫用離心機(中國北京京立離心機)，流式細胞儀(美國Beckman)，個人型細胞分析儀(韓國NanoEntek)，多功能酶標儀VarioskanTMLUX(美國Thermo Fisher)，CO2培養箱。

3 提取外周血淋巴細胞 采集3名25 ～ 30歲男性健康供者靜脈血各60 ml(均取得健康供者知情同意)，置于抗凝管中，輕輕搖勻，取6個50 ml離心管各加入淋巴細胞分離液15 ml，然后沿管壁緩緩加入0.9%氯化鈉注射液稀釋的靜脈血各35 ml，20℃、2 000 r/min離心20 min，吸取中間環狀乳白色淋巴細胞層，PBS緩沖液洗兩遍。

4 分選CD4+T淋巴細胞 將上述外周血淋巴細胞計數，每107個細胞重懸于40μl Buffer緩沖液，并加入10μl Biotin-Antibody Cocktail，混勻放入4℃冰箱5 min，加入30μl Buffer及20μl Anti-Biotin MicroBeads充分混勻放入4℃冰箱10 min。將磁力柱吸附于磁力架上，用3 ml Buffer沖洗磁力柱，將上述制備好的細胞懸液加入磁力柱中收集流出的細胞即CD4+T細胞，流式細胞儀分析CD4+T細胞的分選效率。

5 細胞培養 磁珠分選出的CD4+T細胞直接懸浮在于含有anti-CD3mAb(500 ng/μl)和IL-2(300 U/ml)的培養基中，放置于37℃ 5% CO2培養箱中。3 d后將細胞移至新的培養瓶中懸浮培養，每3 d添加新鮮的培養基及IL-2。

6 細胞增殖實驗 細胞共分為6組，每組6孔。初始細胞數1×105/孔，其中CD4+T細胞組作為對照組，其他各組按照10 nmol/L、30 nmol/L、100 nmol/L、200 nmol/L和1 000 nmol/L添加DAC。分別于3 d、7 d、10 d和14 d使用個人型細胞分析儀進行細胞計數，以細胞數/初始細胞數作為細胞增殖倍數。通過不同濃度DAC對細胞增殖的影響，篩選出促進增殖最佳的最低劑量組。按照上述實驗分組，分別在不同的時間點即0 d、1 d、2 d、5 d和7 d添加DAC，同樣的方法在3 d、7 d、10 d和14 d計算細胞增殖倍數，篩選出促進增殖最佳的時間組，并最終確定添加DAC的最佳劑量和時間，為后續實驗做準備。

7 細胞表型檢測 上述各組細胞在7 d時用流式細胞儀檢測細胞表型，以CD45RO+CD62L+作為中央記憶型T細胞(central memory Tcell，TCM)，以CD45RO-CD62L+作為干細胞樣中央記憶型T細胞(stem cell-like memory Tcell，TSCM)。

8 腫瘤細胞殺傷實驗 采用基于阻抗的腫瘤細胞殺傷試驗(xCELLigence)來檢測靶細胞的持續溶解。Raji細胞被電鍍在96孔電阻底板中，每孔5×103個細胞。24 h后，加入5×104個效應細胞。共分3組，每組6孔，包括DAC處理的CD4+T細胞+Raji細胞組、CD4+T細胞+Raji細胞(對照組)以及不添加效應細胞的Raji細胞組。每15 min集測量1次基于阻抗的標準化細胞指數，監測時間為96 h。標準化細胞指數則通過測量由Raji腫瘤細胞黏附引起的晶體管平板上的電流阻抗確定。

9 細胞因子檢測 細胞分2組，每組6孔，細胞數5×105/孔，包括DAC處理的CD4+T細胞和對照組CD4+T細胞。各組細胞培養7 d時，分別加入Raji細胞，細胞數5×104/孔。24 h后使用ELISA試劑盒和多功能酶標儀檢測IL-2、FasL、IFN-γ和TNF-α的分泌。

10 統計學方法 使用SPSS22.0進行研究資料分析。觀測資料主要為計量數據，均通過正態性檢驗，以-x±s描述。兩組間的比較為成組t檢驗或校正t檢驗(統計量為t)，多組比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD。檢驗水準α=0.05。

結 果

1 CD4+T細胞的分選效率 通過人類CD4+T細胞磁珠分選試劑盒和磁力柱對人外周血淋巴細胞進行分選，磁力柱中流出來的細胞即CD4+T細胞，經過流式細胞儀分析CD4+T細胞的分選效率為95.36% ～ 97.51%，能夠達到實驗所需要的純度(流式代表圖見圖1)。

圖1 分選CD4+ T細胞Fig. 1 Selection of CD4+ subsets from Tcells

2 添加DAC的最低劑量及最佳時間 通過不同劑量和添加時間篩選出促進CD4+T細胞增殖最佳的DAC劑量和時間：1)劑量：5種不同劑量DAC實驗結果提示，3 d時各組細胞均出現增殖，其中200 nmol/L和1 000 nmol/L組細胞增殖倍數顯著低于對照組(P＜0.05)，其他各組和對照組細胞的增殖倍數無統計學差異(P＞0.05)。7 d時各組與對照組細胞的增殖倍數差異顯著，其中10 nmol/L、30 nmol/L和100 nmol/L組細胞增殖倍數顯著高于對照組(P＜0.05)，200 nmol/L和1 000 nmol/L組細胞增殖倍數顯著低于對照組(P＜0.05)。10 d時各組間細胞增殖均有統計學差異(P＜0.05)。14 d時10 nmol/L、30 nmol/L和100 nmol/L組細胞增殖倍數顯著高于對照組(P＜0.05)，200 nmol/L和1 000 nmol/L組細胞增殖倍數顯著低于對照組(P＜0.05)。由此篩選出促進細胞增殖效果最佳的最低DAC劑量為10 nmol/L，并作為后續實驗的使用劑量(圖2A)。2)時間：確定DAC添加實驗劑量后，進一步實驗探索DAC添加時間：分別在5個不同的時間點添加10 nmol/L DAC。結果顯示，3 d時各時組間的細胞增殖均無統計學差異(P＞0.05)。7 d、10 d和14 d時，Day0、Day1和Day2組的細胞增殖倍數均顯著高于對照組(P＜0.05)，而Day5和Day7組細胞增殖倍數與對照組無統計學差異。另外，Day0、Day1和Day2組的組間細胞增殖倍數以及Day5和Day7組的組間細胞增殖倍數均無統計學差異。通過實驗證實，在細胞培養3 d以后添加DAC，幾乎不再影響細胞的增殖。因此，由此最終確定了添加DAC的最低劑量和最佳時間為10 nmol/L、Day 0(圖2B)。

3 DAC修飾的CD4+T細胞的記憶表型增強 7 d時檢測記憶細胞表型(CD45RO，CD62L)。結果顯示，TCM表型(CD45RO+CD62L+)較對照組顯著增加(P＜0.001)，TSCM表型(CD45RO-CD62L+)較對照組也顯著增加(P＜0.05)。結果提示DAC有助于提高CD4+T細胞記憶性，中央記憶型T細胞以及干細胞樣中央記憶型T細胞的比例增加最為顯著(圖3)。

圖2 不同劑量和時間點添加DAC對CD4+ T細胞增殖的影響(aP＜0.05； n=3)A： 不同劑量； B： 不同時間Fig. 2 Effect of adding DAC at different doses and time points on the proliferation of CD4+ Tcells (aP＜0.05； n=3)A: Different doses； B: Different time points

圖3 低劑量DAC對CD4+ T細胞記憶表型的影響Fig. 3 Effect of low-dose DAC on memory phenotype of CD4+ Tcells (aP＜0.05； bP＜0.001；n=3)

圖5 低劑量DAC對CD4+ T細胞接觸腫瘤抗原后細胞因子分泌能力的影響Fig. 5 Effect of low-dose DAC on cytokine secretion of CD4+ Tcells exposed to tumor antigen (aP＜0.05； bP＜0.001；n=3)

4 DAC修飾的CD4+T細胞腫瘤溶解能力增強 通過xCELLigenceⅠ阻抗系統進行96 h效靶比(E∶T)為10∶1的殺傷實驗，結果顯示DAC修飾的CD4+T細胞腫瘤溶解能力優于對照組，說明DAC能夠維持CD4+T細胞持續抑制腫瘤的能力(圖4)。

5 DAC修飾的CD4+T細胞的細胞因子分泌增強將培養7 d的效應細胞與腫瘤細胞按照10∶1的比例進行共培養，24 h后收集培養上清進行ELISA檢測。結果顯示，DAC修飾后的CD4+T細胞與Raji細胞共培養后其分泌的IL-2、FasL、IFN-γ以及TNF-α顯著高于對照組，說明DAC修飾的CD4+T細胞遇到抗原后，分泌細胞因子的能力增強，而這些細胞因子可以促進T細胞增殖及增強細胞毒性(圖5)。

討 論

T淋巴細胞在抗腫瘤免疫應答中發揮著重要的作用，以T細胞為主的過繼性免疫細胞在腫瘤免疫治療領域也越來越受到重視。雖然T細胞相關的過繼性免疫治療需要經過體外的擴增培養或基因工程化改造，但是主要分群仍然是CD4+和CD8+T細胞，兩者相互協調共同發揮抗腫瘤功效[13-14]。幼稚CD4+T細胞可以根據特征性效應細胞因子和轉錄因子分化為不同輔助性T細胞(Th)，CD4+T細胞的持續性和記憶性是T細胞體內長時間抗腫瘤的關鍵[15]。CD8+T細胞是T細胞發揮腫瘤殺傷作用的主要細胞群，但是缺失CD4+T細胞的幫助會導致嚴重的CD8+T細胞耗竭[16]。因此，如果能夠體外增強CD4+T細胞的功能，可能是提高過繼免疫細胞療效的關鍵。

本研究探索了5種不同劑量和5個不同時間點添加DAC對CD4+T細胞增殖的影響。實驗結果顯示，高劑量的DAC，尤其是超過200 nmol/L劑量時，在體外培養過程中會降低CD4+T細胞的增殖。在1 000 nmol/L時，T細胞會出現大量的死亡。在10 ～ 100 nmol/L劑量范圍內，DAC能夠促進CD4+T細胞的增殖。值得注意的是，無論是CD4+還是CD8+T細胞，來自中央記憶型T細胞亞群比效應記憶型T細胞亞群具有更加持續性的抗腫瘤能力[13,17-18]。本研究證實，DAC修飾的CD4+T細胞TCM表型以及TSCM表型顯著增加。

圖4 低劑量DAC對CD4+T細胞持續抑制腫瘤能力的影響Fig. 4 Effect of low-dose DAC on long-term tumor inhibition ability of CD4+ Tcells(n=3)

當T細胞處于耗竭狀態時，其分泌的細胞因子IL-2、TNF-α和IFN-γ等降低，從而降低了細胞的溶解及增殖能力[19]。本研究通過ELISA檢測效應細胞和腫瘤細胞共培養后細胞因子的分泌結果提示，DAC組的IL-2、FasL、IFN-γ以及TNF-α較對照組顯著增高。IL-2是促進T細胞增殖的關鍵細胞因子，而FasL、IFN-γ以及TNF-α則是T細胞發揮細胞毒作用的關鍵細胞因子。DAC不但能夠促進細胞增殖相關的細胞因子分泌，同時還能夠促進細胞毒相關的細胞因子分泌，與相關研究觀察到DNA去甲基化能夠增強體內IL-2及INF-γ分泌的結果相符[10,20-21]。在細胞因子分泌增多的同時，本研究觀察到了DAC修飾的T細胞對腫瘤細胞殺傷作用的增強。CD8+T細胞是發揮抗腫瘤作用的主要作用細胞，CD4對與腫瘤細胞的殺傷作用很弱。但本研究觀察到，在DAC處理后CD4的抗腫瘤能力有了明顯的提高，雖然無法達到100%清除腫瘤細胞能力，但相對于未修飾CD4+T細胞，DAC修飾后的CD4+T細胞對腫瘤細胞發揮了長效抑制作用。

綜上所述，本實驗結果提示，低劑量DAC能夠顯著促進CD4+T細胞增殖和記憶表型，并提高持續抑制腫瘤細胞增長和分泌細胞因子的能力。在此研究基礎上，我們將進一步通過動物實驗驗證DAC修飾的T細胞的抗腫瘤功效，進行基因組學水平分析探索DAC對CD4+T細胞關鍵轉錄因子以及信號通路等的影響。