硬度可控的溫敏水凝膠基底對兔角膜內皮體外擴增內皮間質化的影響

李宗源，吳耀祖，劉晶劼，劉羽陽，王麗強

1解放軍總醫院第一醫學中心 眼科，北京 100853；2解放軍總醫院研究生院，北京 100853；3清華大學醫學院，北京 100084

角膜內皮細胞(corneal endothelial cell，CECs)起源于神經外胚層，是一層緊密連接組成的單層六邊形細胞，附著在角膜后彈力層上，通過Na+-K+- ATP酶和Mg2+- ATP酶主動將角膜基質中的水泵入前房中，在維持角膜脫水狀態和透明中起到重要作用。出生時，人類角膜內皮層細胞密度約為5 000/mm2，由于角膜內皮細胞在體內存在有絲分裂抑制，因此CECs隨年齡增長細胞密度呈下降趨勢。從妊娠中期到10歲之間，細胞密度呈快速的非線性下降趨勢，這可能與角膜面積增大、細胞老化和細胞凋亡相關。之后的階段細胞密度每年以0.6%的速度遞減。當角膜損傷、角膜內皮疾病或自然衰老導致細胞密度小于500/mm2時，角膜內皮將失去其泵水功能，從而導致角膜基質水腫、角膜混濁，最終導致視力下降[1]。包括板層角膜移植、穿透性角膜移植、角膜內皮移植在內的角膜移植是一種可靠的治療方式[2-3]。但角膜供體移植物在世界范圍緊缺，工程化角膜移植材料是解決這一問題的新途徑。在種子細胞的獲取方式上，體外擴增CECs是一種潛在的解決方案。但內皮細胞在體外擴增時內皮間質轉化(endothelium mesenchymal transition，EnMT)和細胞衰老制約著這一策略的可行性。近年有研究指出，物理參數如機械硬度可調節細胞EnMT程度。因此我們推測，生物工程底物能夠模擬后彈力層的物理機械特性，從而降低CECs細胞體外擴增時的EnMT過程[4]。本研究通過底物對兔角膜內皮生長的影響，旨在改進角膜內皮細胞體外擴增質量，提供工程化角膜內皮材料所需要的種子細胞，為生物工程內皮材料治療大泡性角膜病變提供前景。

材料與方法

1 實驗動物 4 ～ 5周齡、1 ～ 2 kg雌雄不限健康新西蘭白兔6只，來自解放軍醫院實驗動物中心。本研究經中國人民解放軍總醫院動物倫理委員會批準。

2 主要試劑 聚乙二醇二丙烯酸酯(PEG)(Sigma)、異丙基丙烯酰胺(NIPAM)(Sigma)、丙烯酰胺(Amresco)；6孔細胞培養板(Corning)、24孔細胞培養板(Corning)、48孔細胞培養板(Corning)、48孔板專用細胞爬片(Solarbio)；硫酸妥布霉素溶液；高糖DMEM培養基(Corning)、胎牛血清(FBS)、Express Enzyme(Invitrogen)、膠原酶Ⅰ (Sigma)、山羊血清(中杉金橋)、PBS緩沖液(Corning)、硫酸軟骨素(Sigma)、層粘連蛋白(Sigma)、FNC 涂層(ENZO)；小鼠抗兔α-平滑肌動蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)一抗(Abcam，ab7817)；山羊抗小鼠IgG(Abcam，ab97022)；含DAPI熒光封片劑(中杉金橋)。

3 不同硬度PEGDA水凝膠的制備 本實驗使用了清華大學杜亞楠教授團隊的可調節硬度的溫敏PEG-NIPAM體系。按照文獻[4-5]報道的方法制備不同硬度溫敏水凝膠：將數均分子量為4 000 g/mol的PEG改性為聚乙二醇雙丙烯酸酯(PEGDA)。用自由基聚合法將NIPAM與丙烯酰胺(acrylamide，AM)和PEGDA共聚。NIPAM和AM的摩爾比是95∶1。在蒸餾水中制備NIPAM/PEGDA溶液，其中NIPAM與PEGDA的重量/體積百分比(NIPAM/PEGDA)分別為1% PEG-NIPAM(NIPAM∶PEGDA=10% ∶ 1%)；10% PEG-NIPAM(NIPAM ∶ PEGDA=10%∶10%)和20% PEG-NIPAM (NIPAM∶PEGDA=10%∶20%)。0.2%的過硫酸銨(APS)和0.1%的四甲基乙二胺用于膠凝固的啟動。將配好的溶液澆鑄到載玻片上。將PEG-NIPAM水凝膠凝固成型時間統一固定為30 min，制備好的水凝膠需在紫外線照射下滅菌2 h，做細胞培養前需乙醇浸泡1 h，PBS清洗3次。水凝膠材料保存于4℃，通常水凝膠在制備后1周內使用，使用前提前24 h在4℃中進行涂層的預鋪板。基于PEG的熱敏水凝膠具有良好的光學性能，透明，形態穩定[4,6]。不同硬度水凝膠的體積相變溫度均低于生理條件下溫度，這使得溫度響應型水凝膠適合通過溫度控制進行細胞收獲，如細胞相互融合，可利用溫差變化將細胞成片收下，呈膜樣形態。

4 AFM法測定材料硬度 首先用熱振動法在玻璃蓋玻片上校準懸臂，用洛倫茲函數擬合得到的熱譜來確定彈簧常數。測量在37℃的細胞培養基中進行，每次測量得到的力與壓痕曲線由JPKSPM數據處理軟件利用Hertz模型分析，得到水凝膠的準確模量。

5 原代兔CECs的提取和培養 參照文獻[7-8]利用兩部法提取兔原代角膜內皮細胞。取4 ～ 5周齡6只新西蘭兔完整12只新鮮眼組織，減除多余筋膜肌肉組織，浸泡于含1%青霉素/鏈霉素/兩性霉素B和0.5%硫酸妥布霉素的PBS緩沖液中30 min。PBS緩沖液沖洗干凈后沿角膜緣完整剪下角膜組織。將剪下的完整角膜置于高糖DMEM無血清培養基中，利用無齒鑷在角膜內皮面完整撕下Descemet膜，注意時刻變換夾取位置，防止損傷內皮細胞，整個過程在體視顯微鏡下進行。將撕下后帶角膜內皮的Descemet膜置于200μl含有2 mg/ml膠原酶的高糖DMEM培養基的48孔板中。37℃孵育3 ～ 4 h后，CECs從Descemet膜上脫落并形成大的細胞團簇。CECs團簇在1×TE酶中進一步消化2 ～ 3 min，進一步分離成更小的團簇和單個細胞，以1 200 r/min離心5 min，在10% FBS、1%青霉素/鏈霉素/兩性霉素B的高糖DMEM中重懸細胞，種植于6孔細胞培養板中，此為細胞P0代。在隨后的研究中，通過1×TE分離消化并傳代CECs，分別在不同硬度材料和預鋪板涂層的條件下培養CECs，具體分組如下：三種預鋪板條件(硫酸軟骨素、層粘連蛋白混合物；纖維連接蛋白、膠原蛋白、白蛋白混合物；明膠)與不同濃度(1%、10%和20%)PEG制備的PEGNIPAM分別兩兩組合以及對照組(細胞培養板，TCP)，共10組。當細胞密度約為90%時進行細胞傳代，相應組別細胞分別在對應的條件下繼續傳代培養。所有細胞培養在37℃含5% CO2濕潤空氣中。隔日更換1次培養基。

6 兔CECs免疫熒光染色 培養細胞在含4%多聚甲醛中固定10 min，PBS洗滌3次×5 min；室溫下用0.25% Triton溶液處理15 min，PBS洗滌3次×5 min；10%山羊血清封閉30 min；然后將細胞與目標一抗按照說明書稀釋后4℃孵育過夜。復溫30 min，PBS洗滌3次×5 min，室溫下避光孵育FITC二抗(1：1 000) 1 h，PBS洗滌3次×5 min。所有樣品在室溫下避光用含DAPI封片劑密封。利用共聚焦顯微鏡(LEICA SP8)拍攝免疫熒光圖像。

7 統計學分析 采用SPSS19.0統計學軟件進行數據處理，本文數據均為計量資料且符合正態分布，以-x±s表示，三組比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 水凝膠硬度 利用原子力顯微鏡AFM法對水凝膠硬度進行測定，濃度1% PEG制備的PEGNIPAM硬度為(346.4±26.53) Pa，濃度為10% PEG制備的PEG-NIPAM硬度為(8 782±444.4) Pa，濃度為20% PEG制備的PEG-NIPAM硬度約為(11 518±791.1) Pa，這些與細胞培養板(TCP)相比均較軟(1 GPa)。見圖1。

圖1 AFM測定不同濃度PEG制備的PEG-NIPAM的彈性模量Fig. 1 PEG-NIPAM hydrogel stiffness was measured through an AFM-based mechanical tester (aP＜0.001)

2 兩步法提取兔原代內皮細胞 倒置顯微鏡下可觀察到Descemet膜在液體中自然卷曲，角膜內皮細胞連接緊密，呈六角形規則地排布在Descemet膜上(圖2A)。加入膠原酶Ⅰ后，內皮細胞邊界皺縮，細胞間緊密連接松散，立體感增強，呈星形形態(圖2B、圖2C)。進一步消化3 ～ 4 h后，細胞呈大的團簇狀脫落，輕輕吹打后，內皮細胞脫離光滑的Descemet膜，進一步加入1×TE酶消化后，大細胞團簇進一步被解離為小的細胞團簇和單個細胞，離心吹打后可制成細胞懸液，這種兩步法消化的優勢是降低胰酶消化帶來的細胞損傷。內皮細胞在12 h后貼壁，呈卵圓狀或六邊形狀，形態規則立體感強(圖2D)；隨著培養時間增長在細胞接種1 ～ 2 d后，細胞較之前逐漸扁平化，個別細胞出現細胞極性增長，暫時失去典型的六邊形和鋪路石形態(圖2E)；在接種后3 ～ 4 d，隨著細胞密度增加，細胞間緊密連接的建立，內皮細胞又恢復了規則的六邊形形態(圖2F)。

圖2 光鏡下后彈力層和角膜內皮體外培養形態(10×)A：后彈力層； B、C：加入膠原酶后內皮細胞連接松散與角膜內皮細胞皺縮為星型形態； D、E、F：體外細胞培養12 h、1 d 和4 d 形態Fig. 2 The morphology of thec u l t u red Des c emet ' smembrane and cornealendothelium under opticalmicroscope (10×)A: Descemet's membrane；B, C: After the additionof collagenase, the endothelialcells are looselyconnected, and the cornealendothelial cells contractinto a star shape； D, E, F:Morphology after 12 h, 1 dand 4 d in vitro cell culture

圖3 P0 ～ P3代兔原代內皮細胞體外培養光鏡下形態和免疫熒光法檢測α-SMA表達A、B、C、D： P0、P1、P2和P3代兔CECs光鏡下形態，由典型的六邊形內皮形態逐漸變為細胞觸角增多、極性明顯的纖維化細胞形態；E、F、G、H： P0、P1、P2和P3代兔CECs的α-SMA表達，α-SMA陽性細胞密度逐漸增加Fig. 3 Morphology and α-SMA immunof l uorescence expression of P0-P3 rabbit primary CECs in vitro A, B, C, D: Rabbits CECs morphology of P0 (A), P1 (B), P2 (C) and P3 (D). The typical hexagonal endothelial morphology changes into fi brotic cell morphology with proliferating tentacles and obvious polarity； E, F, G, H: Expression of α-SMA in rabbits CECs of P0 (E),P1 (F), P2 (G) and P3 (H). The density of α-SMA positive cells increased gradually

3 兔原代內皮細胞體外培養EnMT變化 將后彈力層上CECs經過三代培養后，細胞三維形態也逐漸由立體形態逐漸變大扁平。采用免疫熒光法檢測EnMT標志物α-SMA的表達，以確定除形態變化外，骨架蛋白是否也發生了EnMT過程。在離體后貼壁6 h的兔CECs中，α-SMA沒有明顯的熒光信號表達，12 h開始出現極少量α-SMA陽性細胞。在P1代檢測到少量α-SMA弱陽性細胞。隨著細胞培養時間和細胞代數的增加，α-SMA陽性細胞的比例和表達強度逐漸增加，最終細胞骨架呈棘狀的非內皮形態(圖3)。這些結果表明，EnMT自發地發生在體外培養的兔CECs中。

4 不同硬度水凝膠和涂層對內皮EnMT的影響本實驗中3.4 kPa(濃度1% PEG)的基底過于柔軟，難以支撐兔CECs的生長，8.8 kPa(濃度10% PEG)的基底細胞生長較11.5 kPa(濃度20% PEG)的基底慢；兔CECs在不含ECM涂層的PEG-NIPAM上，細胞分裂速度非常慢，需要很長時間才能達到融合。在P0 ～ P3培養期間，不同的底物上培養的CECs存在明顯差異。不同底物的細胞形態也不相同，但在與兔Descemet膜硬度和組成成分相似的基底(20% PEG-NIPAM，11.5 kPa)中，α-SMA陽性細胞的比例低于對照組TCP(圖4)。表明接近原本生物學組成的ECM基底有利于抑制體外EnMT的過程。最終我們們發現與Descemet膜的彈性模量和生物學組成相似的基底將最大程度減少CECs體外培養過程中EnMT的程度。

討 論

圖4 免疫熒光法檢測P1 ～ P3代兔原代CECs中α-SMA表達P1 ～ P3代兔CECs在濃度為20%的PEG制備的PEG-NIPAM和TCP表面預鋪以層粘連蛋白+硫酸軟骨素混合涂層與FNC涂層進行培養，利用免疫熒光法檢測α-SMA表達。 P1 ～ P3的CECs中α-SMA陽性細胞逐漸增加，細胞骨架轉變為纖維化形態；20% PEGNIPAM相比于TCP對照組α-SMA陽性細胞比例和強度明顯減少；層粘連蛋白和硫酸軟骨素的混合涂層相比于FNC涂層α-SMA陽性細胞比例和強度減少Fig. 4 α-SMA expression in P1-P3 rabbit CECs by immunof l uorescence P1-P3 rabbit CECs are pre-coated with FNC or laminin + chondroitin sulfate on the surface of PEG-NIPAM or TCP, respectively,and the expression of α-SMA is detected by immunof l uorescence. The α-SMA positive CECs cells of P1-P3 increase gradually, and the cytoskeleton changes into fi brotic morphology. The proportion and fl uorescence intesity of α-SMA positive cells in the 20% PEGNIPAM group signif i cantly decreases compared with the TCP control group. Compared with FNC coating, the α-SMA positive cells proportion and fl uorescence intesity decreases in the laminin and chondroitin sulfate mixed coating

在單細胞和多細胞生物的組織器官和循環系統中，均存在細胞對刺激信號產生極化反應的現象，具體表現為運動能力增強[9]。這種定向運動對于組織發育、血管生成、損傷修復和炎癥反應都是必要的。各種刺激會誘導細胞發生運動，這些刺激包括趨化因子、結合性配體和微電流。生化組成上的差異(如膠原蛋白和纖維連接蛋白)也可能導致局部硬度的差異，通過整合素由外向內傳導信號影響細胞的運動[10]。通過交聯或改變基質濃度可導致微環境的空間變化從而改變硬度，這也是本實驗的實驗基礎。在以往的研究中，堅硬的底物會使細胞發生黏附和重組，這是細胞定向運動過程的開始，伴隨著力的產生和傳導。以上已經在干細胞、癌細胞、中性粒細胞和血小板中得到證實[11]。除此之外，細胞可依據細胞核的硬度、細胞滲透壓和細胞膜感知外界硬度，在亞細胞水平上調節自身的硬度。

以往的研究結果表明，與天然Descemet膜有著相似生物組成和彈性模量的仿生PEG-NIPAM基底可以最大程度維持CECs的表型[12-13]。在此我們利用兔原代CECs在硬度與生物體內相似的粘連蛋白和硫酸軟骨素的混合涂層的PEG-NIPAM與其他基底組培養，發現在P1 ～ P3擴增的CECs與其他組相比細胞大小、α-SMA表達等指標得到改善。目前，大部分研究聚焦于廣泛的可溶和不可溶分子改善CECs的培養。如CECs在Ⅳ型膠原蛋白、Laminin、FNC和纖連蛋白的涂層上得到了不同程度的有效擴增。其他方法還包括添加可溶性的生長因子，如ROCK抑制劑Y27632、抗壞血酸、bFGF、EGF、TGF-β抑制劑和NGF等[7,14-18]。本實驗利用對細胞損傷更小的兩部消化法將基質彈性模量與ECM涂層相結合的方式[7]，研究物理因素在細胞動力學和細胞骨架遷移導致EnMT的影響，在不添加額外的生長因子和小分子化合物的條件下，利用DMEM培養基和血清及少量抗生素對比不同基底對CECs的EnMT的影響。我們選擇了EnMT的一個明確的細胞骨架標志物α-SMA作為衡量EnMT過程進行研究，其在已轉化為成纖維細胞的內皮細胞中會有明顯表達。在TCP上標準傳代的過程中已確定CECs會在P1代出現表達α-SMA的CECs；在P2和P3時，α-SMA表達的細胞密度增加和表達強度明顯增強，并出現清晰的肌動蛋白應力纖維。借助改變PEG濃度進而改變PEG-NIPAM材料的硬度這一特性，我們研究了硬度對CECs對于EnMT的影響。在涂層相同但硬度不同的TCP與其他濃度的PEG-NIPAM基底相比，在與天然結構和硬度相似的仿生基底上，由EnMT導致的α-SMA表達增多的程度最輕。這也表明了物理因素影響著CECs體外培養過程。此外，由于CECs直接在PEG-NIPAM的材料上分裂速度較慢，我們在培養前對材料基底進行預鋪板，發現不同涂層對于CECs的培養也具有一定影響，最接近天然ECM成分的涂層細胞生長最好。本研究主要是基于原代細胞的離體實驗，還缺少在體動物層面的研究，其作用機制還有待完善。

綜上，在全世界角膜移植手術的大量開展，角膜供體嚴重匱乏，體外培養角膜內皮細胞的效率不能滿足工程化角膜內皮移植物生產的大背景下，本研究提供了一個高質量獲得工程化角膜內皮材料的種子細胞的思路，希望能在現有的小分子化合物和改良培養方法的基礎上通過物理因素的改變更好地獲取種子細胞，解決CECs體外擴增的EnMT過程這一關鍵性問題。我們下一步的實驗將研究在角膜內皮體外培養過程中，改變彈性模量是通過哪條通路抑制EnMT過程，爭取篩選出特異性靶點以解決世界范圍內角膜供體匱乏的難題。