21三體綜合征妊娠母體血清代謝組學研究

劉曉婷，梁臻龍，陳天艷，張晨晰，張立文，高志英，游艷琴，王成彬

1解放軍總醫院第一醫學中心 醫學檢驗中心，北京 100853；2云南昆鋼醫院 檢驗科，云南昆明 650032；3解放軍總醫院第一醫學中心 婦產科，北京 100853

21三體綜合征(簡稱T21綜合征)，也稱為唐氏綜合征，是一種常見的人類非整倍體疾病，約占所有活產胎兒非整倍體的四分之一[1-3]。T21綜合征可導致不同程度的身心畸形，其特點是智力低下，發育遲緩，面部特征明顯[4-6]。目前，血清學篩查(包括甲胎蛋白、人絨毛膜促性腺激素和雌三醇)聯合羊膜腔穿刺術是產前篩查和診斷T21綜合征的主要方法[7-9]。但是由于血清學篩查的假陽性率高、羊膜腔穿刺術的有創性及培養時間長等缺點，故急需篩選出T21綜合征相關特異的標志物，建立針對T21綜合征的新型輔助診斷方法。代謝組學是繼基因組學和蛋白質組學之后新近發展起來的一門學科，是系統生物學的重要組成部分[10]。它是研究代謝組在某一時刻細胞內所有代謝物的集合的一門學科。其研究結果可以很好地反映生物體的表型，揭示某些疾病狀態或生理狀態的分子特征。代謝組學主要研究生物體液、組織以及細胞中的小分子，是基因組與蛋白組學的補充，可以用于生物標志物與疾病發生機制的探索。小分子代謝物對機體內源性和外源性變化較mRNA和蛋白質更敏感，對識別疾病狀態下各種代謝物有巨大潛力與價值。目前常用的代謝組學平臺有氫核磁共振(1H NMR)、氣相色譜聯合質譜(GC-MS)、液相色譜聯合質譜(LC-MS)以及超高效液相色譜聯合質譜(UPLC-MS)[11-15]。核磁共振優點是操作簡單及靈活性較好，但靈敏度較低、檢測范圍有限；氣相色譜聯合質譜優點是靈敏度和特異性較好，但分析時間較長，且需要衍生化；液相色譜聯合質譜靈敏度較高、處理簡單，但其分離性能不佳。與傳統的液相色譜相比，超高效液相色譜聯合質譜具有靈敏度更高、分離速度更快等優點。目前，有關T21綜合征的研究多停留在蛋白組學上，代謝組學研究較少。因此本研究應用目前先進的UPLC-MS技術，以期篩選出妊娠母體血清中與T21綜合征相關的特異性代謝物，探討T21綜合征發病相關的代謝通路和發病機制。

材料與方法

1 研究對象 16例正常組樣品來自胎兒核型正常的孕婦，16例T21組樣品來自胎兒核型為T21綜合征的孕婦，兩組孕婦的年齡、孕周(18 ～ 22周)、所懷胎兒性別等臨床資料基本一致，收集兩組孕婦的血清各1 ml，300μl/管分裝于500μl EP管內，凍存于-80℃冰箱。所有樣本均來自于解放軍總醫院第一醫學中心。本研究的所有參加者均已簽訂科研知情同意書，并經醫院倫理委員會批準同意。

2 儀器設備 樣品抽提機(Geno/Grinder2010，美國SPEX SamplePrep)；自動化移液機器人(MicroLab STAR?系統，瑞士漢密爾頓公司)；氮吹儀(SPE Dry Dual sample concentrator，美國 Biotag)；超高效液相色譜(Acquity 2D UPLC，美國Waters)；離子軌道阱高質量精度高分辨質譜儀(Q Exactive orbitrap，美國ThermoFisher Scientific)；臺式高速冷凍溫控離心機(5810-R，美國Eppendorf)；真空冷凍干燥儀(free-Zone，美國LABCONCO)；冰箱(DW-86L728J，中國海爾)。

3 試劑耗材 LC/MS級甲醇(貨號34860，HPLC純，純度高于99.9%)、甲酸(貨號251364，純度高于96%)和碳酸氫銨(貨號A6141，純度高于99.9%)均購自美國SIGMA公司；EP管(Eppendorf，0.5 ml/1.5 ml)；C18色 譜 柱 (美 國 Waters公 司，UPLC BEH C 18 ～ 2.1 mm×100 mm，1.7μm)；HILIC柱 (美 國 Waters公 司，UPLC BEH Amide 2.1 mm×150 mm，1.7μm)。

4 樣品前處理 首先，各樣品加入甲醇提取液進行抽提，提取混合液在樣品抽提機上垂直震動提取2 min后進行離心。然后，樣品中的蛋白質經過有機試劑抽提后變性進入沉淀，上清則含有小分子的代謝物。最后，提取后的每份上清液使用自動化移液機器人分別轉移到5塊樣品板上后用氮吹儀進行吹干，以去除有機溶劑。五塊板用途如下。A板：針對親水性代謝物的正離子電噴霧電離模式(positive ESI)下的反相超高效液相色譜-串聯質譜(RP UPLC-MS/MS)分析；B板：針對疏水性代謝物的正離子電噴霧電離模式(positive ESI)下的反相超高效液相色譜-串聯質譜(RP UPLC-MS/MS)分析；C板：負離子電噴霧電離模式(negative ESI)下的反相超高效液相色譜-串聯質譜(RP UPLC-MS/MS)分析；D板：負離子電噴霧電離模式(negative ESI)下的親水相互作用超高效液相色譜-串聯質譜(HILIC UPLC-MS/MS)分析；E板：即最后一份樣品用于需要重新測試時的備用板。

5 超高效液相色譜-串聯質譜分析(UPLC-MS/MS)UPLC-MS/MS分析方法均采用Waters ACQUITY 2D超高效液相色譜和使用加熱電噴霧離子源HESI-II的Q-Exactive orbitrap高分辨率/高質量精確度質譜儀，以35 000質量分辨率進行掃描。對上述四種樣品板分別進行以下操作。A板：該塊板上每個吹干的樣品溶解在酸性正離子復溶液，用C18色譜柱進行梯度洗脫，洗脫液A和B分別為含有0.05%的全氟化甲酸和0.1%的甲酸的水和甲醇。B板：該塊板上每個吹干的樣品溶解在酸性正離子復溶液，用C18色譜柱進行梯度洗脫，但是洗脫條件針對更疏水的代謝物進行了色譜優化。洗脫液A和B分別為含有0.05%的全氟化甲酸和0.1%的甲酸的水和甲醇/乙腈。C板：該塊板上每個吹干的樣品溶解在堿性負離子復溶液，用C18色譜柱進行梯度洗脫，洗脫液A和B分別為含有6.5 mmol/L碳酸氫銨，pH 8.0的水和95%甲醇。D板：該塊板上每個吹干的樣品溶解在堿性負離子復溶液，用親水相互作用HILIC柱進行梯度洗脫，洗脫液A和B分別為含有10 mmol/L甲酸銨，pH 10.8的6.5 mmol/L碳酸氫銨，pH 8.0的水和乙腈。MS分析使用動態排除在MS全掃描和數據依賴的MS2掃描之間交替進行。掃描覆蓋范圍為70 ～1 000 m/z。掃描原始數據儲存后進行下一步分析。

6 數據提取和化合物識別 生物信息學系統由四個主要部分組成，實驗室信息管理系統、數據提取和峰值識別軟件、質量控制和化合物識別數據處理軟件，以及一系列用于數據處理分析的統計、可視化和解讀工具。這些生物信息學組件的硬件和軟件是基于運行Oracle 10.2.0.1企業版的LAN數據服務器。原始數據的質量控制和離子峰的提取使用的是基于使用Microsoft的NET技術構建的Web服務平臺，在高性能應用程序服務器和光纖通道存儲陣列上運行以提供故障防止和負載平衡。化合物的鑒定是通過與Metabolon自建的數據庫中用純化標準品獲得的化合物的特征來進行比對識別的。這些標準品特征包含該標準品在測試系統中的保留時間指數、質量與電荷比(m/z)以及MS/MS。對這三個特征進行比對的標準：一個狹窄的RI窗口、與數據庫中標準品的準確質量匹配(+/-10 ppm)以及MS/MS正向和反向比較分數。MS/MS正反比較分數是基于實驗數據中的離子與數據庫中的標準品離子特征的比較。雖然有些化合物彼此之間可能在這三個指標的某項或者某兩項上有相似結果，但在使用所有三個特征來比對以后一般可以得到比較明確的區分。超過4 500種純化的標準化合物在Metabolon所有分析平臺上的數據已經被收藏在Metabolon的數據庫中。對于在實驗中被反復發現同時尚無數據庫匹配的未知代謝物，其特征也被收錄在該數據庫中。這些未知化合物有可能通過將來獲得相應的純化標準品或經典的結構分析手段來獲得識別。

7 統計學分析 采用SPSS23.0統計軟件包。常用的數據多元分析法包括非監督模式的分析和有監督模式的聚類分析：1)非監督模式的分析，是按相似性的特征對原始數據分類，把具有同一類特征的樣本歸類，用可視化技術表達結果。在本實驗中使用的非監督模式的統計分析為主成分分析法(principal component analysis，PCA)；2)有監督的聚類分析是利用已獲得的信息對未知數據進行歸類、識別及預測，在本實驗中使用的有監督模式的統計分析是隨機森林(random forest，RF)。對正常組和T21組血清中鑒定到的代謝物數據進行Welch t檢驗進行比較，P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 主成分分析 經PCA處理的二維矩陣投影圖詳見圖1。圖中坐標軸顯示Comp.1、Comp.2兩種主成分的貢獻比例分別為11.24%和7.86%，兩種主成分的貢獻率之和約20%。因為主成分貢獻率之和不高，并不能發現正常組與T21組存在明顯差異，但可以生成一個明確邊界，如圖1虛線所示，用于識別T21組。

圖1 正常組與T21組的血清代謝組學PCA分析Fig. 1 PCA analysis of serum metabonomics between the normal group and the T21 group The coordinate axis shows the two principal components that have the most effect on the classif i cation of metabolites, which were represented by Comp.1 and Comp.2, respectively. The percentage values in parentheses indicates the contribution of corresponding principal components

2 隨機森林分析 正常組與T21組的血清代謝化合物的RF分析結果見圖2。對正常組與T21組的預測準確性為43.8%(約50%)，具有較高的組間分辨能力。同時，結果表明對組間分類貢獻靠前的主要代謝物種類包括氨基酸類、糖類、聯合因子及維生素類、脂質代謝類、核苷酸代謝類、多肽類等。尤其是氨基酸類，30種代謝物中有11種屬于氨基酸超級家族。結果提示，T21綜合征的病因可能涉及上述代謝物或者代謝物通路的紊亂。

3 前30種差異顯著代謝物分析 表1顯示了對正常組與T21組間鑒別貢獻最大的前30種代謝化合物。Fold of change (T21/Control)表示各個代謝物在T21組中相對于正常組的倍數，當比值大于1時，表示升高；當比值小于1時，表示降低。P值表示各個代謝物在T21組與正常組之間的統計學差異。P值＜0.05，表明該指標在兩組之間存在統計學差異。這些含量差異顯著的代謝化合物包括間酪胺磺胺、N1，N12-二乙酰精胺、羧乙基γ-氨基丁酸、鄰磺基左旋酪氨酸、戊糖酸、2-氮己環酮、苯酚硫酸鹽等，T21組母體血清中約有20種化合物的含量均有不同程度的降低，約10種代謝物水平則升高。

表1 正常組與T21組的前30種血清差異顯著代謝產物Tab. 1 Top 30 serum metabolites differentially expressed between normal group and T21 group

討 論

T21綜合征，即唐氏綜合征，其發病機制為體細胞內多出的一整條或部分的21號染色體，誘導基因表達的異常，從而導致人體內多種蛋白質表達發生明顯改變。代謝組學研究是對生物體內全部代謝物的整體研究，是系統生物科學的重要分支[16-18]。目前，代謝物組學在許多疾病的潛在標志物篩查、復雜疾病或機體病理生理學機制的探索方面逐步應用，在早產或先兆子癇等產科疾病標志物篩查中均有報道，但在T21綜合征中的應用研究仍處于探索階段。我們預測T21綜合征患者體內可能伴隨著某些代謝通路的改變，以及代謝產物種類及含量的異常變化。由于母體和胎兒之間的血液和各種生化物質的交換一直在動態循環變化，母胎循環中異常改變的代謝產物可能出現在母體血液中。因此，對T21綜合征妊娠母體血清進行代謝物組學研究，可能會篩選出T21綜合征妊娠相關的具有特異性的代謝標志物。

目前，液相色譜-質譜聯用技術(GC-MS)已經取代靈敏度低的核磁共振方法，廣泛用于代謝物成分分析[19-22]。代謝組學旨在發現代謝產物的變化，特別是小分子化合物[23]。代謝組學關注的重點在于代謝產物集合的變化，代謝組學分析得到的多維、海量數據必須通過化學計量學的多元統計方法分析處理，才能獲得有價值的信息[24-25]。目前，常用的數據多元分析法包括非監督模式的分析和有監督模式的聚類分析[26-27]。非監督模式的分析，是按相似性的特征對原始數據分類，把具有同一類特征的樣本歸類，用可視化技術表達結果。在本實驗中使用的非監督模式的統計分析為主成分分析法。有監督的聚類分析是利用已獲得的信息對未知數據進行歸類、識別及預測，在本實驗中使用的有監督模式的統計分析方法是隨機森林分析。在本研究中，主成分分析盡管可以生成一個明確邊界在很大程度上識別T21組，但并沒有得出基于實驗分組的明確區別。可能的原因是人類的異質性往往導致代謝物水平的差異較實驗條件下變化更明顯，如樣本之間孕婦的生活地區、生活習慣、自身體質等有關[28]；另外可能與本研究中的樣本量不夠多有關。

機體內生成許多相關的代謝產物，主要包括糖類、脂類、氨基酸、核苷酸、多肽、維生素、血紅素、有機酸等[29-30]。為了篩選與T21綜合征發病可能相關的各種代謝通路的異常變化，鑒定血清含量差異顯著的潛在代謝標志物，本研究對T21綜合征和正常對照組的代謝物進行了RF分析。結果發現對組間分類貢獻靠前的代謝物種類涉及糖類、氨基酸類、血紅素代謝類、能量代謝類、脂質代謝類和核苷酸代謝類等。對正常組與T21組間鑒別貢獻最大的前30種代謝化合物，包括間酪胺磺胺、N1，N12-二乙酰精胺、羧乙基γ-氨基丁酸、鄰磺基左旋酪氨酸、戊糖酸、2-氮己環酮、苯酚硫酸鹽等，有望成為T21綜合征妊娠產前篩查潛在的代謝標志物。它們分別涉及氨基酸代謝、糖代謝、脂類代謝、多肽代謝、核苷酸代謝、血紅素代謝等多種代謝途徑。本研究結果提示T21綜合征妊娠可能與這些代謝通路異常有密切關系。在30種異常代謝化合物中，其中T21組母體血清中約有20種化合物的含量均有不同程度的降低，約10種代謝物水平則升高，提示21三體綜合征的發生可能伴隨有代謝水平不同程度的抑制。下一步我們將會對前期在T21綜合征羊水代謝組學取得的成果[31]與血漿代謝組學得到的代謝物進行差異分析，以期篩選得到2種體液中的共同代謝物，即與T21綜合征相關的特異性代謝物，從而進一步分析T21綜合征患者在各種代謝通路中的差異表達，建立T21綜合征早期輔助診斷模型，以指導臨床針對性地對高風險人群進行早篩查和早診斷。

綜上所述，本研究成功篩選獲得了21三體綜合征可能相關的特異性代謝標志物及代謝途徑。研究結果提示，T21綜合征胎兒妊娠伴隨著母體血清代謝物譜的變化，出現多種代謝化合物含量的顯著變化，主要涉及氨基酸代謝、糖代謝、脂類代謝、多肽代謝、核苷酸代謝、血紅素代謝等多種代謝途徑異常。