白藜蘆醇對急性肺損傷兔內質網應激和細胞凋亡的影響

韓欣潔，孫軍平，張明月，于海容，汪建新

1解放軍總醫院第一醫學中心 呼吸科，北京 100853；2解放軍陸軍第71集團軍醫院 呼吸科，江蘇徐州 221004

急性肺損傷(acute lung injury，ALI)是由嚴重感染、創傷、膿毒癥等多種肺內、肺外因素導致的呼吸系統危重癥疾病，發病機制復雜。ALI作為急性呼吸窘迫綜合征的早期階段，若得不到及時治療，病死率可高達50% ～ 70%[1]。內質網應激(endoplasmic reticulum stress，ERS)是因氧化應激、毒性物質等理化因素引起的內質網功能紊亂狀態，表現為內質網腔內錯誤折疊或者未折疊蛋白聚集以及鈣穩態破壞，作為細胞應激狀態下生存或凋亡的必經之路，ERS既可以激活下游反應途徑促進應激細胞生存，又可以引起Bcl-2、Caspase家族等介導的細胞凋亡。近年來多項研究表明，ERS與ALI等肺部疾病的發生發展密切相關[2-6]。白藜蘆醇(resveratrol，Res)是一種小型非黃酮類多酚化合物，存在于虎杖、葡萄等多種植物中，藥理學研究提示Res具有抗炎、抗氧化、清除氧自由基、抗腫瘤等多種生物活性，在醫學界得到越來越多關注。本實驗研究采用內毒素誘導急性肺損傷動物模型，觀察白藜蘆醇對內質網應激及相關細胞凋亡的影響，探討其對內毒素誘導急性肺損傷的作用。

材料與方法

1 實驗動物 24只雄性3月齡新西蘭白兔，體質量2.3 ～ 2.6 kg，購自解放軍總醫院動物中心，許可證號SCXK(京)2015-0005。

2 主要試劑 脂多糖(lipopolysacchride，LPS)、白藜蘆醇均購自Sigma公司；蛋白提取試劑盒、電化學發光(ECL)檢測試劑盒、TUNEL檢測試劑盒購自北京基譜生物科技有限公司；B淋巴細胞瘤 -2(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)抗 體、Bax抗體、活化轉錄因子4(activating transcription factor 4，ATF4)抗體、轉錄因子C/EBP同源蛋白(C/EBP-homologous protein，CHOP)抗體、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶9(cysteinyl aspartate specific proteinase 9，Caspase 9)抗體均購自北京博奧森生物技術有限公司；蛋白激酶R樣內質網激酶(protein kinase R-like ER kinase，PERK)抗體購自北京安諾倫生物科技有限公司。

3 實驗分組 將兔適應性喂養1周后，隨機數字分組法分為空白對照組、急性肺損傷模型組(ALI組)和白藜蘆醇干預組(Res組)，每組8只。Res組預先給予白藜蘆醇250 mg/kg灌胃7 d，1次/d；對照組和ALI組予等量0.9%氯化鈉注射液代替。三組實驗動物經耳緣靜脈給予25%烏拉坦(4 ml/kg)麻醉并固定，ALT組和Res組按兔重量750μg/kg耳緣靜脈輸注濃度1 g/ml的LPS溶液，建立急性肺損傷模型；對照組給予等量0.9%氯化鈉注射液。實驗開始4 h后，放血處死兔。

4 兔肺組織HE染色病理檢查 放血處死兔后，暴露胸腔后取右肺下葉，0.9%氯化鈉注射液沖洗后置于甲醛溶液中固定24 h，石蠟包埋后切片予蘇木素-伊紅(HE)染色后顯微鏡下觀察。

5 兔肺組織TUNEL染色和圖像分析 肺組織用4%多聚甲醛固定，組織切片經PBS洗滌后進行樣本通透。加入TUNEL檢測液置于37℃預孵育5 min，滴加TUNEL試劑置于濕盒內37℃孵育1 ～ 2 h，滴加FITC試劑工作液置于37℃避光孵育30 min，加入DAPI染液復染細胞核后避光室溫孵育10 min。PBS避光洗滌2次，每次5 min，用抗熒光淬滅封片劑封片。鏡下全景掃描，正常細胞核在紫外光激發下為藍色，TUNEL陽性表達為綠色。采用Image-Pro Plus 6.0圖像分析系統，將各組TUNEL染色切片進行圖像分析，每張切片選取5個高倍視野(400倍)，選取的每2個高倍視野之間至少間隔1個高倍視野，計算凋亡指數(apoptosis index，AI)，AI=高倍視野內TUNEL染色陽性細胞數/細胞總數×100%，并計算平均數。

6 兔肺組織濕/干重比(wet/dry，W/D)檢測 取左肺組織0.9%氯化鈉注射液沖洗后濾紙吸干，稱濕重；再置于70℃烤箱內烘干24 h，稱干重；計算W/D。

7 Western blot檢 測 肺 組 織 中 PERK、ATF4、CHOP、Caspase9、Bcl-2、Bax的蛋白表達 按照試劑盒要求提取肺組織樣本中蛋白；待測蛋白行凝膠電泳(SDS-PAGE)，電泳后濕轉法轉移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上；5%脫脂牛奶封閉1h后，分別予Bcl-2(1∶500)、Bax(1∶500)、PERK抗體(1∶ 500)、ATF4(1∶ 500)、CHOP(1∶ 500)或甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)抗體(1∶3 000)與PVDF膜孵育，4℃過夜；以含吐溫的三羥甲基氨基甲烷緩沖液(TBST)洗膜后加入羊抗兔辣根過氧化酶標記二抗，置于37℃孵育50 min；最后TBST洗膜后ECL曝光、顯像，行半定量分析。

8 RT-PCR檢測肺組織中PERK、ATF4、CHOP、Caspase 9、Bcl-2、Bax mRNA表達 按試劑盒要求提取肺組織樣本中總RNA，1%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測RNA的完整性。取總RNA用mRNA cDNA Synthesis Kit進行反轉錄，mRNA/lncRNA qPCR Kit進行擴增，擴增程序：95℃預變性30 s，(95℃ 5 s，60℃ 30 s)×45個循環，實驗操作步驟均按產品說明書進行。以GAPDH為內參基因，采用2-△△CT法進行數據的相對定量分析。實驗中應用的引物序列如下，Bcl-2上游引物：5'-GGATGCCTTCGTGG AACTGT-3'，下游引物：5'-TCTTCAGAGACACCCA GGAGAA-3'；Bax上游引物：5'-CGACGGCAACTTCAACTGG-3'，下游引物：5'-ATGGTGAGTGAGGC GGTGA-3；CHOP上游引物：5'-GCTCG'CCAGAGTCTAGTCAG-3'，下游引物：5'-CGTTCTCTTGTTCCT TCTCCTTC-3'；ATF4上游引物：5'-ACGGACTGGA TGTTGGAGAAAG-3'，下游引物：5'-AGGTCGTCC AAGCTCAGCA-3'；Caspase9上游引物：5'-TCTATG GCACGGACGGATAC-3'，下游引物：5'-CCTGGATGAAGAAGAGCTTGG-3'。

9 統計學方法 使用SPSS22.0進行研究資料分析。觀測資料中的計量數據，均通過正態性檢驗，以-x±s描述。兩組間的比較為成組t檢驗或校正t檢驗(統計量為t)。多組間的比較為單因素方差分析(統計量為F)+兩兩比較LSD-t檢驗(統計量LSD-t)。檢驗水準α=0.05。

結 果

1 各組兔肺組織HE染色病理形態 肺組織切片經HE染色后顯微鏡下觀察：對照組兔肺組織結構未見明顯異常，肺泡腔內未見出血、滲出、炎癥細胞浸潤，肺泡間隔未見增厚，肺間質血管未見明顯異常；ALI組兔肺組織可見彌漫性炎癥改變，肺泡間隔明顯增厚，其內可見出血，肺間質毛細血管擴張、微血栓形成，微血管內可見中性粒細胞附壁，血管內皮細胞腫脹；Res組肺泡腔未見明顯出血、滲出、炎癥細胞浸潤，肺泡間隔稍增厚，間質血管損傷程度明顯輕于ALI組。結果提示，LPS誘導ALI模型成功，應用Res后可減輕ALI的肺組織損傷。見圖1。

2 兔肺組織TUNEL染色和凋亡指數 對照組可見極少量TUNEL染色陽性細胞，ALI組和Res組可見大量肺泡間隔細胞TUNEL染色陽性，細胞凋亡較多；Res組肺泡間隔細胞TUNEL染色陽性數目明顯少于ALI組，見圖2；肺泡間隔凋亡指數，Res組(27.85%±2.89%)明顯低于ALI組(42.22%±3.20%)，差異有統計學意義(n=8，P＜0.001)。

3 兔肺組織濕/干重比(W/D) ALI組肺W/D值(4.20±0.54)較對照組(3.06±0.47)升高(P＜0.001)，RSV組W/D值(3.48±0.30)較ALI組肺降低(n=8，P＜0.001)，差異均有統計學意義。

4 肺組織PERK、ATF4、CHOP、Caspase 9、Bcl-2、Bax的蛋白和mRNA表達 對Western blot檢測的條帶灰度掃描后進行對比，并計算出各組肺組織 PERK、ATF4、CHOP、Caspase 9、Bcl-2、Bax mRNA的相對定量結果，以空白組中一肺組織樣本為對照樣本，計算各組目的基因轉錄水平的差異，對比得出：ALI組PERK、ATF4、CHOP、Caspase 9、Bax蛋白水平和mRNA表達顯著高于Res組(n=8，P＜0.001)，Res組Bcl-2蛋白水平和mRNA表達高于ALI組(n=8，P＜0.001)，差異均有統計學意義(圖3，表1，表 2)。

圖3 各組兔肺組織PERK、 ATF4、 CHOP、 Caspase 9、 Bcl-2、 Bax蛋白表達Fig. 3 PERK, ATF4, CHOP, Caspase 9, Bcl-2, Bax protein expressions in rabbit lung tissue of each group

圖1 光鏡下兔肺組織病理學改變(HE 400×)Fig. 1 Pathological changes of rabbit lung tissue under light microscope (HE 400×)

圖2 兔肺組織TUNEL染色(400×)Fig. 2 TUNEL staining of rabbit lung tissue(400×)

表1 各組兔肺組織PERK、ATF4、CHOP、Caspase 9、Bax、Bcl-2的蛋白表達Tab. 1 Protein expressions of PERK, ATF4, CHOP,Caspase 9, Bax and Bcl-2 in rabbit lung tissue of each group(n=8)

表2 各組兔肺組織PERK、ATF4、CHOP、Caspase 9、Bax、Bcl-2的mRNA表達Tab. 2 mRNA expressions of PERK, ATF4, CHOP,Caspase 9, Bax and Bcl-2 in rabbit lung tissue of each group(n=8)

討 論

ALI是由非心源性因素如嚴重感染、大量輸血、創傷等導致的急危重癥疾病，病理表現為肺泡上皮細胞及毛細血管內皮細胞損傷，彌漫性肺間質及肺泡水腫，臨床表現為急性進行性低氧性呼吸功能不全，病情發展至嚴重階段(氧合指數＜200)被稱為急性呼吸窘迫綜合征，發病機制復雜，臨床病死率高。尋求新的有潛力和前景的治療藥物，減輕肺部損傷、保護殘余肺功能，降低病死率，一直是臨床治療和科學研究的目標。

內質網應激是因多種理化因素如氧化應激、營養物質剝奪、毒性物質、缺氧等引起的內質網功能紊亂狀態，通過激活內質網膜上感受器，引起下游自我保護反應—未折疊蛋白反應、內質網超負荷反應和固醇調節級聯反應。PERK是位于內質網膜上的Ⅰ型跨膜激酶，與Bip解離后的PERK自身寡聚磷酸化激活，選擇性翻譯編碼ATF4 mRNA，ATF4進一步誘導CHOP基因表達，抑制抗凋亡蛋白Bcl-2基因表達，引起Bcl-2/Bax比例失調，激活Caspase蛋白酶家族，最終引起應激細胞凋亡[7]。越來越多的研究表明，內質網應激及細胞凋亡參與了多種因素誘發的ALI[5,8-9]。

隨著對中藥及其有效成分的研究深入，越來越多的中藥及其有效成分因其安全、有效、價格低廉逐漸被應用于臨床。白藜蘆醇，化學名是(E)-3，5，4'- 三羥基二苯乙烯 [(E)-3，5，4'-trihydorxystilbene]，是植物面對感染、強光暴露等應激條件下產生的植物多酚類化合物，主要從桑葚、花生、葡萄、虎杖根莖中提取的一種天然活性物質，已被證實可以用于肥胖、激素依賴性腫瘤、心血管系統疾病的治療[10]。多項研究提示，白藜蘆醇因對ALI的保護作用具有良好的研究前景。粟青等[11]研究表明白藜蘆醇可通過抑制NLPR3炎性小體活化，降低IL-1β、IL-18等活化后產物的表達，減輕LPS誘導的小鼠ALI。何梅英和陳文婷[12]實驗發現，白藜蘆醇通過調節膿毒癥大鼠NF-κB通路抑制炎癥反應，發揮對ALI的保護作用。于紅和朱冬菊[13]的動物研究表明，白藜蘆醇可以下調ALI小鼠肺組織GRP78、ATF6、IRE-1ɑ的表達水平，通過拮抗內質網應激反應從而減輕ALI。

本實驗中，相比于對照組，ALI組肺組織病理損傷更為嚴重，兔肺組織可見彌漫性炎癥改變，肺泡間隔明顯增厚，其內可見出血、肺間質毛細血管擴張、微血栓形成，微血管內可見中性粒細胞附壁和血管內皮細胞腫脹；應用白藜蘆醇后可減輕ALI的肺組織損傷，保護肺組織結構完整性。肺組織濕/干重比是反映肺水腫程度的重要指標，應用白藜蘆醇干預后的肺組織濕/干重比明顯低于LPS組(P＜0.05)，提示白藜蘆醇可以減輕ALI肺水腫程度。本研究通過TUNEL染色結果發現，ALI組肺泡間隔細胞凋亡指數較Res組升高(P＜0.05)。ALI組兔肺組織內質網應激標志蛋白和細胞凋亡蛋白PERK、ATF4、CHOP、Caspase 9、Bax的蛋白水平和基因表達明顯增加，抗凋亡蛋白Bcl-2蛋白水平和基因表達減少；而白藜蘆醇干預后下調了兔肺組織 PERK、ATF4、CHOP、Caspase 9、Bax的蛋白水平和基因表達，上調Bcl-2的蛋白水平和基因表達(P＜0.05)。提示白藜蘆醇有拮抗內質網應激、減輕細胞凋亡的作用，與相關國內外研究一致。然而，內質網應激涉及的上下游分子通路錯綜復雜，相關具體作用機制有待進一步深入研究。

綜上所述，本實驗通過成功復制LPS誘導ALI兔模型，證實白藜蘆醇可以通過抑制內質網應激和細胞凋亡，發揮對ALI的保護作用，為白藜蘆醇的臨床應用提供了理論基礎。隨著對相關藥理機制研究的深入，白藜蘆醇顯露出良好的臨床應用前景，可為臨床治療提供更多選擇。