四水合七鉬酸銨細菌內毒素檢查方法研究

崔 黎 韓 峰（內蒙古自治區(qū)藥品檢驗研究院呼和浩特010020）

四水合七鉬酸銨為白色結晶性粉末，為混合微量元素注射液（10）的原料藥之一。根據《中國藥典》2015年版“化學藥品注射劑安全性檢查法指導原則”的要求，作為注射劑原料，應對其安全性指標作為內控標準進行考察。參照《中國藥典》2015年版四部通則方法，對四水合七鉬酸銨細菌內毒素限量檢查的可行性進行了方法驗證。

1 實驗方法與結果

1.1 限值的確定：按照《中國藥典》2015年版四部細菌內毒素檢查法提供的公式L=K/M進行限值的確定。注射劑K=5 EU/kg·h。四水合七鉬酸銨為混合微量元素注射液（10）的原料之一，混合微量元素注射液（10）的臨床最大使用劑量為2瓶/人，每瓶中溶質約為100 mg（實際為95.2 mg），內毒素的限值：L=K/M=5 EU/KG/200 mg×60 kg=1.5 EU/mg。本著從嚴原則，擬定為：每1 mg四水合七鉬酸銨含細菌內毒素的量應小于0.2 EU。

1.2 實驗材料

1.2.1 儀器：細菌內毒素測定儀：型號BET-48G，天津天大天發(fā)科技有限公司；旋渦混合器：型號IKA MS3 DS25，廣州儀科實驗科技有限公司。

1.2.2 供試品：四水合七鉬酸銨批號：20160301、20160302、20160303。

1.2.3 試劑

1.2.3.1 鱟試劑：生產單位：湛江安度斯生物有限公司

規(guī)格：0.1 mL，批號：1603142，靈敏度：0.03 EU/mL

規(guī)格：0.1 mL，批號：1512181，靈敏度：0.125 EU/mL

生產單位：湛江海洋生物有限公司

規(guī)格：0.1 mL，批號：1601043，靈敏度：0.03 EU/mL

規(guī)格：0.1 mL，批號：1601110，靈敏度：0.125 EU/mL

1.2.3.2 細菌內毒素工作標準品：生產單位：中國食品藥品檢定研究院，規(guī)格：80 EU/支，批號：150601—201478。

1.2.3.3 內毒素檢查用水：生產單位：湛江安度斯生物有限公司，規(guī)格：5 mL/支，批號：1602160。

1.3 鱟試劑靈敏度復核試驗：按照《中國藥典》2015年版四部通則1143細菌內毒素檢查法規(guī)定，進行鱟試劑靈敏度復核，結果見表1、表 2。

表1 鱟試劑靈敏度復核

結果：4批鱟試劑經用細菌內毒素工作標準品檢查，λc為λ的0.5～2.0倍，結果均符合規(guī)定。

1.4 干擾實驗預實驗

1.4.1 最大有效稀釋濃度（MVC）的計算：由公式MVC=λ/L

其中L為四水合七鉬酸銨的細菌內毒素限值0.2 EU/mg，市售鱟試劑靈敏度λ范圍在0.5 EU/mL～0.03 EU/mL。

則四水合七鉬酸銨對應有效稀釋濃度為：

MVC0.5=0.5 EU/ml÷0.2 EU/mg=2.50 mg/mL

MVC0.25=0.25 EU/ml÷0.2 EU/mg=1.25 mg/mL

MVC0.125=0.125 EU/ml÷0.2 EU/mg=0.62 mg/mL

MVC0.06=0.06 EU/ml÷0.2 EU/mg=0.30 mg/mL

MVC0.03=0.03 EU/ml÷0.2 EU/mg=0.15 mg/mL

1.4.2 實驗操作：稱取四水合七鉬酸銨46.08 mg，加入內毒素檢查用水2.3 mL充分溶解后，用內毒素檢查用水分別稀釋為2.50 mg/mL、1.25 mg/mL、0.62 mg/mL、0.30 mg/mL、0.15 mg/mL，即為NPC。

同時在上述系列溶液中加入細菌內毒素標準溶液，使試驗液中均含有2 λ及0.25 λ濃度的細菌內毒素，記此系列溶液分別為PPC1和PPC2，每一濃度重復兩管。

取兩個不同廠家的鱟試劑，靈敏度為0.25 EU/mL，分別與上述PPC和NPC溶液進行反應，并設陽性和陰性對照。結果見表 2、表 3。

表2 四水合七鉬酸銨干擾預試驗（湛江安度斯生物有限公司，批號：1512181 λ=0.125EU/mL）

表3 四水合七鉬酸銨干擾預試驗（湛江海洋生物有限公司，批號：1601110 λ=0.125EU/mL）

由以上干擾預實驗結果可以初步了解：兩個廠家的鱟試劑對四水合七鉬酸銨的細菌內毒素實驗結果在0.15 mg/mL濃度及以下濃度時無干擾。

1.5 正式干擾實驗：據預實驗結果，將3批供試品用細菌內毒素檢查用水稀釋至終濃度為0.15 mg/mL的溶液，作為供試品陰性對照溶液，取內毒素工作標準品配成濃度為0.25，0.125，0.0625，0.03125 EU/mL的含供試品（濃度為0.15 mg/mL）溶液，同時做陰性對照和陽性對照。照《中國藥典》2015年版四部通則1143中的干擾試驗，結果見表4、表5。

表4 四水合七鉬酸銨鈷干擾試驗（湛江安度斯生物有限公司，批號：1603142 λ=0.03EU/mL）

表5 四水合七鉬酸銨干擾試驗（湛江安度斯生物有限公司，批號：1601043 λ=0.03EU/mL）

表4、表 5 結果表明：ES在 0.5 λ～2 λ 之間，且 ET在 0.5 ES～2 ES范圍內。說明0.15 mg/mL四水合七鉬酸銨在此試驗條件下，對鱟試劑與細菌內毒素工作標準品反應無干擾。因此可以確認四水合七鉬酸銨對鱟試劑無干擾的最大濃度為0.15 mg/mL，使用標示靈敏度為0.03 EU/mL鱟試劑可對四水合七鉬酸銨進行細菌內毒素檢查。

1.6 樣品細菌內毒素檢查：按《中國藥典》2015年版細菌內毒素檢查法，取標示靈敏度為0.03 EU/mL的鱟試劑進行檢查，用細菌內毒素檢查用水（BET）將細菌內毒素標準品稀釋成4 λ，2 λ（陽性對照溶液）濃度的溶液，再將3批樣品用細菌內毒素檢查用水（BET）制成供試品溶液，同時作供試品陽性對照、陽性和陰性對照。分別用不同企業(yè)鱟試劑進行試驗，結果見表6、表7。

表6 四水合七鉬酸銨細菌內毒素檢查樣品細菌內毒素檢查結果（安度斯，批號：1603142）

表7 四水合七鉬酸銨細菌內毒素檢查樣品細菌內毒素檢查結果（海洋，批號：1601043）

表6、表7結果表明，使用上述兩個廠家靈敏度為0.03 EU/mL的TAL對樣品進行檢驗，結果符合規(guī)定。

2 結果與討論

2.1 干擾預實驗結果表明：四水合七鉬酸銨在0.15 mg/mL及其以下濃度對鱟試劑凝集反應無增強或抑制作用。

2.2 正式干擾實驗表明：0.15 mg/mL及其以下濃度對鱟試劑凝集反應無增強或抑制作用。分別考察不同企業(yè)生產的鱟試劑反應結果一致，ES/ET均在0.5～2.0之間，確定無干擾，說明本品可用標示靈敏度0.03 EU/mL鱟試劑進行細菌內毒素檢查。

2.3 按照擬定的限值對三批四水合七鉬酸銨進行了內毒素限量檢查，結果均符合規(guī)定。

2.4 實驗結論：根據以上試驗，可以制定四水合七鉬酸銨檢查方法，取本品照（《中國藥典》2015年版四部通則1143）檢查，四水合七鉬酸銨中含內毒素的量應小于0.2 EU/mg。