微生物學快速現場評估在支氣管鏡下診斷肺部感染的價值

房宇坤 李玉 王劍 陳瑾瑤 宋嘉 沈青 吳麗君 陳清勇

[摘要]目的 探討微生物學快速現場評估（M-Rose）在支氣管鏡下對肺部感染的診斷價值。方法 回顧性分析2018年1～8月在浙江省解放軍903醫院的104例均行支氣管鏡的肺部感染患者，每位患者支氣管鏡下的分泌物均進行微生物學快速現場評估，并同時將標本常規送檢，檢測病原學，并以送檢的結果為金標準，比較M-Rose和檢驗科報告結果的符合率。結果 104例患者的檢驗科結果報告（細菌學涂片）中，有明確病原學92例，無明確病原學12例;其中革蘭陽性菌55例，革蘭陰性菌17例，結核3例，真菌4例，混合感染14例（其中包括1例真菌合并未明確病原菌的細菌感染）。M-Rose的評估結果中，有明確病原學94例，無明確病原學10例;其中革蘭陽性菌56例，革蘭陰性菌17例，結核3例，真菌5例，混合感染15例（包括1例結核合并未明確病原菌的細菌感染，1例真菌合并未明確病原菌的細菌感染）;兩者的確診率比較差異無統計學意義（P>0.05）。以檢驗結果為金標準，M-Rose對細菌陽性的診斷敏感度為100.00%，特異度為90.91%;對結核的診斷準確率為100.00%;對真菌的診斷敏感度為80.00%，特異度100.00%，總體診斷符合率為98.91%。M-Rose對肺部感染的診斷結果與檢驗科病原學結果的一致性好（Kappa=0.907，P<0.001）。結論 M-Rose在支氣管鏡下對肺部感染的患者有較高的診斷價值，有助于對感染患者進行病原學的初步評估，可以為未來的臨床治療提供早期的治療依據。

[關鍵詞]肺部感染;微生物快速評估;病原微生物;支氣管鏡

[中圖分類號] R563? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1674-4721（2020）5（b）-0004-05

Value of microbiological rapid on-site evaluation in the diagnosis of pulmonary infection under bronchoscope

FANG Yu-kun1? ?LI Yu1? ?WANG Jian1? ?CHEN Jin-yao2? ?SONG Jia1? ?SHEN Qing1? ?WU Li-jun1? ?CHEN Qing-yong1▲

1. Department of Respiratory and Critical Medicine， the 903th Hospital of PLA， Zhejiang Province， Hangzhou? ?330000， China; 2. Department of Medical Biology， University of Sydney， Sydney? ?2050， Australia

[Abstract] Objective To explore the value of microbiology rapid on-site evaluation （M-Rose） in the diagnosis of pulmonary infection under bronchoscope. Methods A retrospective analysis was made on 104 patients with bronchoscopic pulmonary infection in the 903th Hospital of PLA in Zhejiang Province from January to August 2018. The secretions of each patient under bronchoscope were evaluated on the spot by microbiology， and the samples were sent to the laboratory for testing at the same time， taking the report of the laboratory as the gold standard. The results of M-Rose and laboratory report are compared. Results Among the 104 cases， 92 cases had definite etiology， 12 cases had no definite etiology， including 55 cases of Gram-positive bacteria， 17 cases of Gram-negative bacteria， 3 cases of tuberculosis， 4 cases of fungi， and 14 cases of mixed infection （including one case of fungus combined with bacterial infection of unknown etiology）. A total of 94 cases of M-Rose had definite etiology， there were 10 cases with no definite etiology， including 56 cases of Gram-positive bacteria， 17 cases of Gram-negative bacteria， 3 cases of tuberculosis， 5 cases of fungi， and 15 cases of mixed infection （including one case of tuberculosis with bacterial infection of unknown etiology， one case of fungus with bacterial infection without definite pathogen）. There was no significant difference in the diagnosis rate between the two detection methods （P>0.05）. With the test results as the gold standard， the sensitivity and specificity of M-Rose were 100.00% and 90.91% respectively. The tuberculosis diagnostic accuracy of M-Rose was 100.00%， the fungus sensitivity of M-Rose was 80.00%， the specificity was 100.00%， and the overall diagnostic accuracy was 98.91%. The results of M-Rose in the diagnosis of pulmonary infection were in good agreement with the results of etiology in the laboratory （Kappa=0.907， P<0.001）. Conclusion M-Rose has a high diagnostic value for patients with pulmonary infection under bronchoscopy， which is helpful for the preliminary evaluation of the etiology of the patients with pulmonary infection， and can provide early treatment basis for the future clinical treatment.

[Key words] Pulmonary infection; Microbiology rapid on-site evaluation; Pathogenic microorganism; Mronchoscope

肺部感染是一種由多種病原體（細菌、病毒、真菌、寄生蟲等）感染引起的常見呼吸系統疾病，發病率和致死率居高不下。尤其是對于重癥和老年患者，肺部感染的發生率占據首位[1-2]。在對39家醫院的ICU感染患病率調查統計中發現，ICU獲得性感染前三位的分別是肺部感染、血液感染和泌尿道感染[3]。所以，肺部感染是很多重癥和老年患者搶救失敗的重要原因，也常常讓臨床醫生對其束手無策[4]。近年來，隨著微創介入技術的快速發展和下呼吸道耐藥病原菌感染的增加，在呼吸危重癥患者的治療過程中，對于病原感染微生物的迫切需求，臨床上已經將介入技術如電子支氣管鏡、肺泡灌洗、支氣管鏡超聲技術、電子導航超細支氣管鏡技術等先進手段廣泛應用于肺部感染性疾病的診斷和治療中，而微生物快速現場評估（microbiology rapid on-site evaluation，M-Rose）技術也應運而生[5-6]。M-Rose是指對于利用介入法采集的感染源標本（氣道分泌物或者支氣管灌洗液）進行現場制片染色，并在短時間可以根據染色結果對于感染病原得出初步診斷[7]。本研究通過回顧性分析104例肺部感染的患者，并將所有患者行支氣管鏡檢查聯合M-Rose快速評估，探討分析M-Rose對肺部感染患者在介入支氣管鏡中的診斷價值。

1資料與方法

1.1一般資料

回顧性分析2018年1～8月解放軍903醫院呼吸內科收治并全部采用Olympus BF-260型號的支氣管鏡診斷為肺部感染的104例患者，其中男62例，女42例;年齡22～85歲。本研究通過醫院醫學倫理委員會論證并通過，研究對象知情并簽署知情同意書。所有患者術前完善血常規、超敏反應蛋白、心電圖、凝血全套、乙肝三項、HIV和梅毒抗體等檢查。納入標準：①確診為肺部感染，胸部CT有滲出性病灶;②排除行支氣管鏡檢查的禁忌。排除標準：①有活動性大咯血的患者;②嚴重的高血壓、心律失常或者有不穩定心絞痛發作的患者;③不能糾正的出血傾向，如凝血功能嚴重障礙、尿毒癥等患者;④嚴重的上腔靜脈阻塞綜合征。

1.2材料

快速革蘭染色染色液;抗酸染色液（珠海貝索生物技術有限公司）;真菌染色液（江蘇供贏聯）;顯微鏡（Olympus CX-31型號顯微鏡）。

1.3術前準備

術前完善血常規、超敏反應蛋白、心電圖、凝血類、乙肝三項、HIV和梅毒抗體等檢查，明確有無支氣管鏡操作禁忌證;常規完善CT檢查，并將CT數據傳至虛擬導航（VBN軟件）自動讀入數據重建三維支氣管，術前仔細研讀患者胸部影像資料;告知患者術前禁食、禁水。

1.4操作過程

患者取仰臥位，鼻導管吸氧，術中時刻監測患者的生命體征;對于重癥患者，予以床邊支氣管鏡檢查。經鼻或口進鏡，常規支氣管鏡依次觀察氣管、隆突、雙側各級支氣管，于病灶處吸引收集呼吸道分泌物。

1.5標本染色

1.5.1革蘭染色? 將用氣管鏡吸取患者氣道分泌物在專用載玻片上進行薄涂（2～3次），然后進行常規的革蘭染色。將標本加熱固定，采用結晶紫進行初染（1 min），水洗后，采用碘液進行媒染（1 min），清水沖洗后95%乙醇脫色（20 s），最后沙黃復染（1 min），水洗印干油鏡下觀察。若視野中出現紫色球（桿）狀細菌，則為革蘭陽性球（桿）菌;若視野中出現紅色球（桿）菌，則為革蘭陰性菌球（桿）菌。

1.5.2抗酸染色? 將用氣管鏡吸取的患者氣道分泌物在專用載玻片上進行薄涂（2～3次），然后進行抗酸染色。將標本加熱固定后，采用石碳酸復紅初染（3 min，弱火），水洗后，3%鹽酸乙醇脫色（20 s，2次），水洗后，亞甲藍復染（1 min），水洗印干油鏡下觀察。若視野中出現紅色細長，略彎曲的桿菌，則為結核桿菌。

1.5.3真菌熒光染色? 將用氣管鏡吸取的患者氣道分泌物在專用載玻片上進行薄涂（2～3次），然后進行真菌熒光染色。將熒光染料直接滴在載玻片的氣道分泌物中，將其充分混勻后，蓋上蓋玻片，熒光鏡下觀察。若視野中出現熒光，則為真菌陽性。

1.6結果判讀與判斷

①M-Rose結果由2名經驗豐富的臨床微生物學醫師用顯微鏡觀察細菌的形態與數量，并記錄判讀結果。②M-Rose涂片結果與檢驗科報告的檢驗結果一致為陽性。③以檢驗科結果為金標準，M-Rose涂片結果的靈敏度=真陽性例數/（真陽性例數+假陰性例數）×100%。M-Rose涂片結果的特異度=真陰性例數/（真陰性例數+假陽性例數）×100%。④檢驗科和M-Rose涂片結果均有未明確或有多種細菌的混合性感染，且有些感染最終未能明確病原菌（最終培養及藥敏實驗均未能證實），為進行統計學分析，暫將未明確病原菌的感染記為陰性。

1.7統計學方法

采用SPSS 18.0統計學軟件進行數據分析，計量資料以均數±標準差（x±s）表示，計數資料采用χ2檢驗，M-Rose和檢驗科報告的結果一致性采用Kappa檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1檢驗結果

104例患者檢驗科的結果報告（細菌學涂片）中，有明確病原學的患者為92例，12例未找到明確病原菌，確診率為88.46%（92/104）。其中革蘭陽性菌55例（52.88%），包括革蘭陽性球菌53例，革蘭陽性桿菌2例;革蘭陰性菌17例（16.34%），包括革蘭陰性桿菌16例，革蘭陰性球菌1例;結核3例（2.88%）;真菌4例（3.84%），其中隱球菌2例，白色念珠菌1例，曲霉菌1例;混合感染14例（13.46%），包括1例真菌合并未明確病原菌的細菌感染，后者不包括在前者內，因為有1例混合感染沒有明確病原菌。

2.2 M-Rose結果

104例患者的M-Rose評估結果中，有明確病原學的患者94例，10例未找到明確病原菌，確診率為90.38%（94/104）。其中革蘭陽性菌為56例（53.84%），包括革蘭陽性球菌54例（涂片結果如圖1），革蘭陽性桿菌2例;革蘭陰性菌為17例（15.38%），全部為革蘭陰性桿菌（涂片結果如圖2）;結核3例（2.88%）（涂片結果如圖3）;真菌5例（4.81%）（涂片結果如圖4），其中有隱球菌2例，白色念珠菌1例，曲霉菌2例;混合感染15例（14.42%）（1例結核合并未明確病原菌的細菌感染，1例真菌合并未明確病原菌的細菌感染）。

2.3 M-Rose組與檢驗科病原學診斷率的比較

檢驗科的病原學確診率為88.46%，未能找到病原菌占11.54%;M-Rose的病原學確診率為90.38%，未能找到病原菌占9.62%。兩者的確診率比較，差異無統計學意義（P>0.05）（表1）。

2.4 M-Rose與檢驗結果符合情況的比較

M-Rose對肺部感染的診斷結果與檢驗科病原學結果表現出高度一致性（Kappa=0.907，P<0.001）。以檢驗結果為金標準，M-Rose對細菌陽性的診斷敏感度為100.00%（72/72），特異度為90.91%（10/11）;對結核的診斷準確率為100%（3/3）;對真菌的診斷敏感度為80.00%（4/5），特異度100.00%（4/4）。總體診斷符合率為98.91%（91/92）。

3討論

快速現場評估（Rose）是在微創介入手術中的一種用來快速現場評估標本的方法，其可以通過快速的制片染色等方法確定標本是否為腫瘤、感染、壞死等，并指導標本下一步的分析，如活檢、微生物培養或血細胞計數[8-9]。研究發現，Rose評估大大提高了診斷的準確率，減少了穿刺次數，提高了采集標本的質量[10]。臨床中，肺部感染的患者病原檢出率與留取痰標本的質量成正相關，由于患者的上呼吸道和口腔存在大量的正常菌群，導致收集的痰標本被污染，使病原菌檢出率下降或者病原學診斷錯誤[11-12]。這很容易誘導臨床醫生誤判，進而影響患者的后續治療，也會增加耐藥菌株產生的概率，導致院內感染的發生率增加，同時患者的住院時間以及治療費用也增加。然而，通過介入技術卻可以采集到可靠的感染源標本。有數據表明，支氣管鏡在痰菌培養中的特異性高達80%，敏感性達70%，顯著優于普通留痰的精準度[13-14]。M-Rose可以將收集的分泌物進行涂片并快速鏡檢，很大程度地避免了標本的污染，同時也可以檢驗標本是否合格、是否適宜做培養以及其他染色方法。除此之外，細菌在形態學上有著天然的優勢，可以直接從鏡下觀察細菌的形態進行判斷，如球狀、桿狀、螺旋狀等[15]。真菌和結核的特異性染色優勢，對于M-Rose的判斷更是如虎添翼，真菌的熒光染色陽性，這讓檢測人員可以直接在鏡下判讀部分真菌的菌屬，如白色念珠菌、曲霉菌等;而結核的特異抗酸染色陽性，臨床醫生可以直接鏡檢找到結核桿菌進行診斷用藥，這對于結核早期的篩查與治療有著至關重要的意義[16]。

本研究首次將M-Rose應用于支氣管鏡下的肺部感染患者中，通過回顧性分析本院的104例均行支氣管鏡檢查的肺部感染患者，結果顯示，M-Rose的結果與檢驗科的病原學報告的確診率比較，差異無統計學意義（P>0.05）。M-Rose對肺部感染的診斷結果與檢驗科病原學結果的一致性好（Kappa=0.907，P<0.001）。以檢驗結果為金標準，M-Rose對細菌陽性的診斷敏感度為100.00%，特異度為90.91%;對結核的診斷準確率為100.00%;對真菌的診斷敏感度為80.00%，特異度為100.00%。總體診斷符合率為98.91%。這說明M-Rose在支氣管鏡下對肺部感染的患者有較高的診斷價值，有助于對感染患者進行病原學的初步評估，可以為下一步的臨床治療提供早期依據。

下一步的研究方向要將M-rose與C-Rose相結合，C-Rose的染色可以提供細胞分類與計數及其比例等細胞學判斷，如化膿性炎癥會有大量的中性粒細胞，肉芽腫性炎癥為上皮樣細胞與多核巨細胞，支氣管哮喘則以嗜酸粒細胞和單核細胞為主，除此之外可以重復進行Rose標本取材檢查，兩者結合，病原微生物的判斷加上細胞學分類計數，可以對重癥患者的感染進行初步的估計和療效的預判，這將對于重癥肺部感染患者的治療提供可靠的參考[17]。

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（收稿日期：2018-12-04? 本文編輯：祁海文）