茅臺鎮醬香白酒不同釀造區域可培養酵母種群結構多樣性分析

羅方雯，黃永光,*，涂華彬

（1.貴州大學釀酒與食品工程學院，貴州省發酵工程與生物制藥重點實驗室，貴州 貴陽 550025；2.貴州茅臺酒廠（集團）習酒有限責任公司，貴州 習水 564622）

醬香白酒屬于固態發酵，是多微混菌的開放式發酵過程，在多種微生物菌群相互調控作用下形成獨特的發酵體系和酒體風格[1]，其特殊的酒體風格在于其獨特釀造工藝及釀造環境所形成的特殊微生物區系[2]。其微生物區系包括細菌、酵母、霉菌等菌群結構的演替[3]。其中，酵母不僅能發酵糖類產生乙醇，而且能代謝產生豐富的風味成分，如生香釀酒酵母和假絲酵母等；再如在不同發酵條件下，畢赤酵母可以產生醇、酯、酸等多種風味物質[4-6]，從而影響白酒的產品味感和風味特征。

大曲是一種糖化發酵劑，富含多種酶類和菌類，素有“曲為酒之骨”的說法[7]，醬香大曲更是與產品風味特征密切相關的發酵劑和釀造原料[8]。有研究[9]認為高溫制曲不利于酵母生長，在曲胚出房收曲時檢出酵母很少，甚至檢不出酵母。但通過聚合酶鏈式反應-變性梯度凝膠電泳（polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis，PCR-DGGE）手段對生產之前的高溫大曲研究發現，大曲中存在大量酵母，數量可達103～104CFU/g[10]。這可能與大曲在貯存、使用過程富集環境中的酵母有關。胡曉龍[11]研究發現大曲中的微生物可來源于制曲原材料、空氣、場地、曲房、器具及覆蓋物等；Wang Qiang等[3]通過DGGE研究表明茅臺酒發酵酒醅中微生物來自大曲、窖泥、高粱、空氣及地面微生物；吳徐建[12]分析醬香大曲與釀造過程中的酵母，發現大曲中的酵母進入了發酵過程，但遠不及環境中酵母對釀造過程的貢獻。范光先等[13]從茅臺酒廠周邊生態環境中分離鑒定出11 種酵母。張亞麗[14]從茅臺鎮空氣中分離出16 種酵母。吳徐建[12]從醬香型白酒釀造2～7輪次的環境、大曲以及酒醅中共分離獲得21 種菌落形態各異的酵母，通過比較釀造環境、大曲、酒醅中的酵母相似性，發現空氣中存在的酵母種屬與大曲中的酵母種屬基本一致。以往研究可看出釀造環境及其微生物生態結構對大曲酵母菌群結構、白酒釀造均具有舉足輕重的意義。

釀造環境與大曲都是醬香白酒釀造不可或缺的部分，環境和大曲中的酵母通過堆積富集等途徑進入發酵酒醅，對酒醅的發酵以及酒體風味形成發揮重要作用。但目前仍然鮮見對釀造環境區域及釀酒大曲中酵母的系統研究。為進一步探究環境微生物結構對白酒釀造品質的影響，本課題在前期利用宏基因組學系統分析微生物結構的基礎上，通過可培養方法，對茅臺鎮醬香白酒7 個不同釀造區域1～7輪次釀造環境和大曲中的可培養酵母菌群結構進行一個年度生產期（1～7輪次）的跟蹤分析研究，擬充分認識不同區域釀造環境和大曲之間酵母菌的多樣性結構特征及其關系，解析大曲中酵母的來源，以期為分析各區域白酒品質差別提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

取貴州省仁懷市茅臺鎮觀音寺區、上坪村、椿樹村、巖灘村、向陽村、盧榮壩村及合馬鎮街道社區共7 個釀造醬香型白酒的不同區域，17 個代表性釀酒企業的釀造環境和生產應用大曲樣品。環境取樣點包括：酒廠生產車間的窗戶玻璃表面、窗臺上、晾堂四周墻體表面、晾堂地面、墻角、行車梯梯子及梁柱表面、配電箱表面、消防箱表面、儲酒罐及其他一些平時不易被打掃的角落、車間外地面等。取樣時間為2018年1-9月，茅臺鎮醬香型白酒釀造1～7輪次釀造生產的堆積發酵期。每個企業樣品采集的每次取樣點固定為同一點。按照區域劃分，將從每個酒廠采集的樣品等量混合為一個區域的綜合樣（研究實驗分析樣品，代表一個區域的綜合樣品）。每輪次采集樣品為2 d時間，采集樣品均勻密封袋、專用箱轉運，樣品采集完立即生物性保藏運回實驗室研究分析，留存樣低溫保存。

DNA Marker 上海生物工程（上海）股份有限公司；真菌DNA提取試劑盒 北京索萊寶科技有限公司；核酸染料（Gengreen） 上海賽百盛有限公司；酵母引物（NL1和NL4） 北京全式金生物技術有限公司。

WL營養培養基：酵母粉5.0 g、酸水解酪蛋白5.0 g、葡萄糖50.0 g、磷酸二氫鉀0.55 g、氯化鉀0.425 g、氯化鈣0.125 g、硫酸鎂0.125 g、氯化鐵0.002 5 g、硫酸錳0.002 5 g、溴甲酚綠0.022 g、瓊脂17 g，溶于1 000 mL蒸餾水中，pH 5.5±0.2。麥芽汁液體培養基：麥芽膏粉130.0 g、氯霉素0.1 g，溶于1 000 mL蒸餾水中，pH 5.6±0.2。均購于上海博微生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

超凈工作臺 蘇州金凈科技有限公司；高壓蒸汽滅菌鍋臺式、高速冷凍離心機 美國Thermo Fisher公司；旋渦混合器 海門市其林貝爾儀器制造有限公司；HH-4數顯恒溫水浴鍋 常州澳華儀器有限公司；PCR儀美國伯樂公司；DYY-8C型電泳儀 北京六一儀器廠；JS-680C凝膠成像儀 上海培清科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 酵母菌株分離鑒定

分別稱取各區域最后的綜合樣品25 g于裝有225 mL無菌生理鹽水的三角瓶中，200 r/min振蕩浸提30 min。吸取上清液，稀釋到合適濃度，取100 μL涂布，3 個平行；30 ℃倒置培養1～2 d。挑取不同形態的菌落至已滅菌的WL培養基，純化培養直至得到單菌落，酵母菌的鑒定根據形態持征，可參照《常見與常用真菌》[15]中的方法鑒定。

1.3.2 酵母菌基因組DNA提取

根據北京索萊寶科技有限公司的柱式真菌基因組DNA抽提試劑盒說明書，對酵母菌株進行基因組DNA提取，將提取的菌株基因組DNA置于-20 ℃冰箱中保存備用。

1.3.3 26S rDNA的PCR擴增和產物檢測

引物為NL1（5’-GCATATCAATAAGCGGAGGAAA AG-3’）、NL4（5’-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3’）。PCR體系（25 μL）：primer 1和primer 2各1 μL，DNA模板2 μL，dd H2O 8.5 μL，Mix 12.5 μL。PCR程序：94 ℃預變性5 min，94 ℃變性30 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，35 個循環反應，最后72 ℃繼續延伸10 min[16]。

1%瓊脂糖凝膠檢測擴增目標產物后，送生工生物工程（上海）股份有限公司測序。在NCBI的BLAST數據庫中進行DNA序列比對分析，選取同源性較高的相關菌株的26Sr DNA D1/D2區域序列作為參比分析對象[17]。

1.3.4 菌種保藏

甘油保藏：用接種環挑取純化的菌株于5 mL于己滅菌麥芽汁液體培養基中，30 ℃過夜培養，取0.5 mL培養的渾濁菌液和0.5 mL已滅菌的30%甘油于1.5 mL EP管中混合均勻，每個菌株做3個甘油保藏，標記并放置于-80 ℃冰箱長期保藏。

1.4 數據處理

使用WPS進行數理統計分析，Origin 8.6對各區域環境的酵母種類、數量變化進行統計，采用在線軟件繪制韋恩圖（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/）。

2 結果與分析

2.1 不同區域釀造環境及大曲中可培養酵母菌種分析

從樣品中共分離獲得568 株酵母，其中環境334 株，大曲234 株。環境與大曲酵母根據菌落形態及其顏色特征排重，共送檢202 株。通過酵母26S rDNA D1/D2區域序列比對分析，共鑒定得到15 個屬，36 個種。其中，從環境樣品中鑒定出26 種酵母菌，大曲中鑒定出21 種酵母菌。表1為本課題分離鑒定與其他研究報道酵母菌的比較分析結果。

表1 本課題分離鑒定結果與其他文獻報道酵母菌比較分析Table 1 Comparative analysis between the strains of yeast identified in this study and those reported in the literature

核苷酸序列比對結果（表1）表明，所分離獲得的酵母包括復膜孢酵母屬（Saccharomycopsis）、裂殖酵母屬（Schizosaccharomyces）、紅酵母屬（Rhodotorula）、有孢漢生酵母屬（Hanseniaspora）、柯達酵母屬（Kodamaea）、拜耳結合酵母屬（Zygosaccharomyces）、南極假絲酵母屬（P s e u d o z y m as p）各1 種，隱球菌屬（C r y p t o c o c c u s）、德巴利酵母屬（Torulaspora）、釀酒酵母屬（Saccharomyces）、伊薩酵母屬（Issatchenkia）各2 種，絲孢酵母屬（Trichosporon）3 種，維克漢姆酵母屬（Wickerhamomyces）4 種，畢赤酵母屬（Pichia/Hyphopichia）6 種，假絲酵母屬（Candida）8種，4 株未知屬 N. rattus、H. oryzae、uncultured fungus、uncultured yeast。

Wu Qun等[17]從醬香型白酒釀造過程中鑒定出9 種酵母菌，并且結果表明S. cerevisiae、Z. bailii、P. membranifaciens和S. pombe為堆積過程的優勢酵母。本次實驗從環境和大曲中未分離出Z. bailii、P. membranifaciens，但本課題組其他人員從3、4、5輪次酒醅中分離出Z. bailii，未分離出P. membranifaciens，原因可能是Z. bailii、P. membranifaciens存在于不同輪次酒醅和環境中的差異，且P. membranifaciens是好氧菌，在酒醅中的數量一直很低。釀造環境和大曲中未發現Z. bailii、P. membranifaciens可能的原因是環境和大曲的條件不適合這兩種酵母生存。通過與其他相關研究結果比較，本課題檢出酵母在屬水平和種水平最為豐富，并且在醬香白酒釀造過程中首次檢出10 種酵母，分別為N. rattus、Wickerhamomyces sp. H1Y23、T. faecale、Issatchenkia sp. S612Y5、W. pijperi、Kazachstania sp.IMB190R、Pseudozyma sp.、K. solicola、Torulaspora sp.Z8Y10和H. oryzae；同時也較為系統的對醬香白酒釀造環境區域和大曲的酵母資源進行深入解析，進一步豐富了醬香型白酒釀造微生物資源信息庫。

2.2 不同區域釀造環境酵母種群多樣性結構

圖1 各區域環境樣品酵母酵母種群結構變化Fig. 1 Changes in yeast population structure in environmental samples from various brewing regions

從環境樣品中分離獲得334 株酵母，分屬于14 個屬、26 個種（包括1 株N. rattus和uncultured yeast）。環境樣品酵母多樣性結構分布結果見圖1。由不同酵母菌的檢出頻率可知，W. anomalus、H. burtonii、S. cerevisiae和C. albidus檢出頻率為100%；其次為N. rattus、T. asahii、P. pastoris、T. delbrueckii、P. kudriavzevii和K. ohmeri，檢出頻率為85.71%，C. glabrata和R. mucilaginosa檢出頻率為71.43%，其余酵母菌檢出頻率都低于43%。其中，uncultured yeast、Wickerhamomyces sp. H1Y23、S. paradoxus、C. humilis、M. farinosa、P. galeiformis和T. faecale 7 個種的酵母菌只出現在1 個區域且僅分離出1 株，具有明顯的區域性微生態特征。26 種酵母菌中，相對豐度最大的為W. anomalus（30.24%），其次為S. cerevisiae（20.36%）和H. burtonii（7.78%），相對豐度都超過了7%，其余酵母菌株相對豐度小于4%。

黃永光等[34]對茅臺酒釀造發酵過程中的微生物釀造機理研究表明，其發酵環境為極端釀造環境，屬于高溫、高乙醇、高酸度的微生物生態環境。因此，發酵過程的酵母來源值得進一步探索。大氣空氣環境中已知的細菌和放線菌有1 200 種，真菌有4 000 種，主要來自自然界的水、土壤、動物等[35]。張文平[36]認為醬香型白酒在釀造過程中很大一部分微生物來自空氣。研究顯示[37-38]，Cryptococcus、Hanseniaspora、Pichia、Candida、Debaryomyces、Issatchenki、Rhodotorula、Kodamaea和Wickerhamomyces等酵母屬大量存在于淡水、土壤及生物內臟等，且大部分為土壤優勢菌屬。本課題采集樣品為茅臺鎮釀造醬香白酒的不同釀造環境，主要包括釀造空氣沉降灰塵、釀造車間地面灰塵、釀造區域土壤等，所采集樣品具有充分的代表性，能體現環境樣品特征性。結合環境酵母的檢出頻率和相對豐度，結果表明茅臺鎮醬香白酒釀造環境的酵母菌結構的特征性優勢種為W. anomalus、S. cerevisiae和H. burtonii。這些酵母在大曲和酒醅當中也有適量的存在，由此可知，環境樣品中的酵母主要來自釀造環境的土壤、空氣、水和動植物等，這充分說明特殊釀造環境中的生物資源是白酒釀造過程中酵母菌的重要來源之一，同時也表明釀造環境生態中的本底微生物結構對傳統白酒釀造的重要性，這就是國內外不同酒類釀造產區形成的產業基礎和核心產區釀造微生物結構差異特征，由此才有中國遵義（茅臺）醬香白酒產區、瀘州濃香產區、宜賓濃香產區的特色白酒產業分布結果等。

2.3 不同區域釀造企業生產用大曲酵母種群多樣性特征

從大曲中分離出 234 株酵母，經形態與分子鑒定其分屬于12 個屬、21 個種（包括1 株H. oryzae和uncultured fungus），結果如圖2所示。W. anomalus、S. cerevisiae、H. burtonii和S. fibuligera檢出頻率為100%，其次C. allociferrii、I. orientalis和C. glabrata檢出頻率為85.71%，在6 個區域生產的大曲中均出現；P. kluyveri檢出頻率為71.43%，其余酵母出現區域少于4 個區域，且分離出的酵母數量較少。W. anomalus（95 株）的相對豐度在每個輪次中的比例都比較高，其次為S. fibuligera（23 株）、H. burtonii（15 株）、S. cerevisiae（14 株），其余酵母都低于14 株，其中Trichosporonoides sp. SZ8Y3、uncultured fungus、R. mucilaginosa、S. paradoxus和Pseudozyma sp.只出現在某一區域釀造生產的大曲中，且為1 株。結合酵母菌在大曲中檢出頻率及相對豐度可知，茅臺鎮醬香白酒釀造區域生產大曲中特征性優勢酵母為W. anomalus、S. fibuligera和H. burtonii。其次為S. cerevisiae、I. orientalis和C. glabrata。

圖2 各區域大曲樣品中的酵母種群結構變化Fig. 2 Changes in yeast population structure in Daqu from various brewing regions

郭敏[39]通過高通量對傳統大曲和機械大曲中的真菌進行分析比較，結果表明Wickerhamomyces（傳統制曲為37.32%，機械制曲為4.91%）是其主要真菌屬；Wang Haiyan等[40]對多種大曲DGGE研究結果表明高溫大曲中存在多種酵母，其中P. anomala和S. fibuligera在醬香大曲中處于優勢地位；王曉丹等[25]分離篩選醬香高溫大曲中的酵母菌，在分離時出現大量S. fibuliqura形態的酵母，且S. fibuligera、I. orientalis和H. burtonii在醬香型白酒高溫大曲中均有報道；蔣思峽等[16]從傳統和機械大曲中都分離出S. fibuliqura和S. cerevisiae；朱婷婷[41]用傳統分離方法分析牛欄山大曲真菌的多樣性，得出S. fibuliqura為大曲的優勢菌；高亦豹[10]對不同工藝生產大曲（如口子窖中溫曲、劍南春中偏高溫曲、郎酒高溫曲等）酵母26S rRNA區基因DGGE圖譜分析，發現S. fibuliqura和W. anomalus普遍存在于這些大曲中；王勇[27]運用高通量測序對牛欄山大曲的微生物菌群結構進行研究，得出S. fibuligera是主體真核微生物；喬曉梅等[42]研究得出P. kudriavzevii和S. fibuligera是清香型大曲中的優勢菌；胡佳音等[43]等對清、醬、濃3 種大曲真菌進行多樣性分析，結果表明S. fibuliqura是清香大曲的主要真菌，P. kudriavzevii是濃香大曲主要真菌，Eurotium chevalieri和Thermomyces lanuginosus是醬香型大曲的主要真菌。結合其他研究者的研究結論以及本課題研究結果，說明W. anomalus、S. fibuliqura、P. kudriavzevii、I. orientalis和H. burtonii為一般傳統大曲中的優勢酵母；W. anomalus和S. fibuliqura為醬香大曲的特征性優勢酵母，本研究明確了醬香大曲的優勢酵母菌，為大曲微生物系統化研究提供理論支持。通過與環境檢出酵母相比較分析，大曲與環境中的特征優勢酵母菌的檢出頻率及相對豐度具有一致性，進一步說明茅臺鎮釀造核心區域環境酵母種群結構對醬香白酒釀造質量調控的重要意義。

2.4 不同區域釀造環境與大曲酵母種群結構多樣性差異

圖3 各釀造區域環境、大曲中酵母數量及種類變化Fig. 3 Changes in the number and type of yeast strains in environmental samples and Daqu from each brewing area

由圖3可知，環境和大曲中的可培養酵母數量和酵母種類在各區域的變化上具有基本一致性趨勢。在酵母數量上都呈現先急劇上升后急劇下降，最后趨于平緩的變化規律。其中，2區域酵母數量和種類最多，其原因可能是2區域的條件更適合大多數酵母的生存或該區域的釀酒微生物生態馴化程度很高，使得酵母數量和種類增加，這為醬香白酒企業的選址提供一定的基礎理論。這與吳徐建[12]的報道結論具有相似性，其認為空氣中存在的酵母種屬與大曲中的酵母種屬基本一致。各釀造區域環境的酵母種群數量普遍高于大曲，其中2區域環境酵母數量幾乎是大曲中酵母數量的2 倍，其他各區域的數量變化也遵循此趨勢，其主要原因源于高溫制曲工藝對酵母的篩選和釀造區域生產環境對酵母的富集和馴化，其進一步說明環境微生物馴化及其資源的重要性。從酵母種類來看，環境中的酵母種類數高于大曲，但是差異相差不大。總體而言，環境中的酵母數量和種類都高于大曲，兩者在酵母數量上具有明顯差異，但酵母種類差異不大。結合張亞麗[14]、吳徐建[12]和范光先等[13]的研究結論以及本課題研究結論，說明釀造環境對醬香白酒大曲中酵母的來源具有重要貢獻和調控功能。

圖4 大曲及環境中酵母種群的Venn 分析圖Fig. 4 Venn analysis of yeast populations in Daqu and environmental samples

利用Venn圖可直觀反映釀造環境與大曲在可培養酵母種群結構多樣性方面的共有特征及特有種群的特征性。圖4結果表明，大曲在酵母種群上高達52.38%來自環境。環境與大曲相同的酵母菌為S. cerevisiae、W. anomalus、H. burtonii、C. glabrata、Trichosporonoides sp.SZ8Y3、S. paradoxus、R. mucilaginosa、S. fibuligera、T. delbrueckii、P. kudriavzevii和K. ohmer。醬香型白酒釀造生產應用的高溫大曲需要存放一段時間才能使用，前期的高溫使酵母很少存活或處于休眠狀態，由于環境中的酵母種類多樣性高于大曲，而大曲在貯存過程可富集環境中的酵母，既實現環境中有益酵母向大曲的遷移，又實現了酵母種類數量的富集，使大曲中酵母的多樣性得到增加，為后續的發酵生產提供發酵動力。

3 結 論

對茅臺鎮醬香白酒釀造的7 個不同釀造區域環境及生產大曲的可培養酵母種群結構多樣性進行研究，獲得了568 株酵母菌，先后經形態和26S rRNA D1/D2區序列鑒定，對202 株進行鑒定，最后鑒定為36 種不同酵母。通過對釀造環境及大曲中酵母的多樣性進行分析，得出釀造環境的特征性優勢酵母為W. anomalus、S. cerevisiae和H. burtonii；醬香大曲的特征性優勢酵母為W. anomalus和S. fibuliquras，明確了醬香大曲的優勢酵母菌結構。且環境中的酵母和大曲中的酵母在檢出頻率及相對豐度上具有一致性，進一步說明環境是白酒釀造過程中重要的微生物來源。

環境中的酵母數量和酵母種類高于大曲，其中2區域環境和大曲的酵母數量和種類都高于其他區域，進一步又證實了環境是醬香型白酒釀造微生物的主要來源，為茅臺鎮醬香白酒生產廠地選址奠定了理論基礎，同時也說明了同一釀造大區域內部不同的微生物生態結構差異性特征。與現有文獻報道比較，本課題研究所獲得的N. rattus、Wickerhamomyces sp. H1Y23、Issatchenkia sp. S612Y5、W. pijperi、T. faecale、Kazachstania sp.IMB190R、Pseudozyma sp.、K. solicola、Torulaspora sp.Z8Y10和H. oryzae為首次在醬香型白酒釀造過程檢出的酵母，其在醬香型白酒釀造過程的功能正在開展進一步的詳細研究和功能證實。